冷冻原子探针层析成像技术解析生物大分子的突破性路径

本研究针对蛋白质结构解析中传统技术的局限性，开发了冷冻原子探针层析成像(cryo-APT)技术用于生物分子分析。研究人员通过建立完整的冷冻工作流程，系统研究了氨基酸在水溶液中的碎裂行为，提出水分子簇离子比(CIR)作为电场强度描述符，并评估了基底材料选择、样品制备等关键因素。该研究为冷冻APT技术在生命科学中的应用提供了重要指导，填补了现有技术无法同时获得三维元素分布和亚纳米级空间信息的空白。

　　

在生命科学领域，解析蛋白质等生物大分子的三维结构一直是重大挑战。虽然X射线晶体学和冷冻电子显微镜(cryo-EM)等技术已能提供原子级分辨率的结构信息，但这些方法需要大量分子进行平均化分析，且难以获取关键的组成信息。特别是在研究蛋白质与金属离子的动态相互作用时，如阿尔茨海默病中铜/铁离子与淀粉样蛋白的相互作用，现有技术存在明显局限。原子探针层析成像(APT)作为一种能实现三维元素分布和亚纳米级空间分辨率的技术，为解决这一难题提供了新思路，但其在分析天然水合状态生物分子方面的潜力尚未充分开发。

德国马普学会可持续材料研究所(Max Planck Institute for Sustainable Materials)的Eric V Woods和Baptiste Gault领导的研究团队，在《Microscopy and Microanalysis》上发表了一项开创性研究。他们建立了一套完整的冷冻工作流程，包括液滴浇铸、惰性气体手套箱冷冻、以及通过超低温超高真空穿梭系统进行样品转移，系统研究了氨基酸在水溶液中的行为。研究采用两种纳米多孔金属基底(纳米多孔金NPG和纳米多孔铜CuZn)，在不同分析条件下探索了生物分子冷冻APT分析的关键因素。

研究团队主要采用了三种关键技术方法：(1)完整的冷冻样品制备流程，包括液滴浇铸和超低温转移；(2)利用水分子簇离子比(CIR)作为电场条件指标；(3)使用两种不同类型的局部电极原子探针(LEAP)进行对比分析。研究样本包括半胱氨酸、赖氨酸和精氨酸的冷冻水溶液，以及淀粉样蛋白Aβ1-42纤维。

水基质分析
研究首次提出将水分子簇离子比(CIR)定义为∑(H₂O)_n=1,2,3H⁺/(H₂O)₃H⁺，作为描述电场条件的可靠指标。通过20个数据集的系统分析发现，CIR与激光脉冲能量(LPE)等参数的关系复杂，受样品几何形状和局部成分不均一性等多因素影响。这一发现为后续生物分子分析提供了重要参考标准。

赖氨酸分析
研究揭示了金属基底对质谱分析的干扰问题。在纳米多孔金基底上，未完全去合金化会导致金(Au)和银(Ag)溶解进入溶液，形成金属-有机复合物离子，如Ag(CO)⁺和Au-O复合物，严重干扰有机碎片的检测。这一发现强调了基底材料纯化的重要性。

精氨酸分析
通过分段分析140pJ LPE下获得的1.4亿个离子数据，研究发现不同CIR条件下有机碎片的行为差异：高阶水簇(n=2-5)丰度随CIR增加而下降，而(H₂O)₁H⁺丰度略有上升。特别值得注意的是，质量电荷比34Da的信号被鉴定为可能来自精氨酸完整C骨架的C₅H₂⁺离子，这为生物分子识别提供了新线索。

半胱氨酸分析
在CIR高达73.2的极端条件下，研究发现硫(S)相关信号难以检测，而氯(Cl⁺)信号明显。通过与纯硫样品的对比实验证实，34Da峰更可能是SH₂而非硫离子，这一发现对含硫氨基酸的分析具有重要指导意义。

研究还探索了淀粉样蛋白Aβ1-42纤维在纳米多孔金孔隙中的分析。与干燥样品相比，冷冻水合状态下的纤维显示出完全不同的碎裂模式，验证了水环境对生物分子分析的关键影响。

该研究的结论部分强调了三个关键进展：(1)建立了CIR作为冷冻APT分析的标准指标；(2)阐明了基底材料选择对减少金属干扰的重要性；(3)展示了不同氨基酸的特异性碎裂模式。这些发现为冷冻APT技术在生物分子研究中的应用铺平了道路，特别是在研究蛋白质-金属相互作用等传统技术难以解决的重大科学问题方面具有独特优势。

研究团队指出，未来工作需要进一步优化样品制备技术，如开发高压冷冻(HPF)结合冷冻聚焦离子束(cryo-FIB)的样品提取方法，以减少对纳米多孔基底的依赖。同时，建立标准化的氨基酸参考谱库，并开发机器学习算法来识别蛋白质骨架中的氨基酸序列，将是推动该领域发展的关键方向。这项研究标志着冷冻APT技术正式进入生物分子研究的主流舞台，为生命科学研究提供了全新的分析维度。