假单胞菌KT2440中ISPpu9插入序列通过形成多种环状中间体实现模块化转座

本研究揭示了假单胞菌KT2440中IS110家族成员ISPpu9的独特转座机制。研究人员通过实验证实该插入序列能形成包含转座酶基因(tnp)、小RNA基因(ssr9)或两者组合的环状DNA中间体，解析了其通过A/B盒介导的模块化转座路径。研究发现ISPpu9区别于典型IS110家族成员的转录调控特征，并证明ssr9可作为"自私基因"利用转座酶自主传播，为理解细菌基因组可塑性提供了新视角。

　　

在微生物基因组中，插入序列(IS)作为最简单的移动遗传元件，通过转座作用持续重塑细菌基因组结构。然而，IS110家族成员因其独特的靶向特异性和转座机制，一直是分子微生物学领域的研究难点。假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440作为重要的工业微生物模型，其基因组中散布着7个ISPpu9拷贝，这些元件不仅插入在高度保守的REP（重复基因外回文）序列中，还与小RNA基因ssr9存在复杂关联。这种特殊的基因组布局引发了两个关键科学问题：这些IS元件如何实现精确的靶向插入？其与ssr9的共现现象背后隐藏着怎样的分子机制？

西班牙国家生物技术中心(CSIC, Centro Nacional de Biotecnologia)的Elena Parés-Guillén等研究人员在《Nucleic Acids Research》发表的研究，通过系统的实验解析了ISPpu9的转座机制。研究团队采用自杀性质粒递送系统将ISPpu9转入缺乏该元件的P. putida F1菌株，结合高通量测序和定量PCR(qPCR)技术追踪转座事件；通过设计外向引物PCR检测环状中间体，并构建lacZ报告系统分析启动子活性；利用基因敲除和定点突变验证功能元件的必要性。

研究结果部分呈现了四个重要发现：

ISPpu9的靶向特异性
通过12个独立转座事件的插入位点分析，证实ISPpu9严格选择含AG二核苷酸的REP序列作为靶点（图3）。比较基因组学显示，这种靶向特异性在相关假单胞菌菌株中高度保守，且插入位点下游存在与IS左端A盒相似的短回文序列（图2），暗示其可能参与转座复合体组装。

模块化转座机制
研究检测到四种环状中间体：包含tnp-asr9-ssr9的Junc-1（A-B'连接）、仅含tnp-asr9的Junc-2（A-B连接）、独立ssr9的Junc-3（A'-B'连接）以及含ssr9-tnp片段的Junc-ssr9（图4-5）。qPCR显示Junc-ssr9丰度显著高于其他类型（约4.6拷贝/细胞），表明ssr9可能通过"搭便车"策略利用转座酶自主传播。

独特的转录调控模式
与典型IS110家族成员不同，ISPpu9环状中间体未形成增强转录的杂合启动子（图6）。其tnp基因依赖固有启动子P_tnp表达，而相关元件ISPpu10则保留典型的杂合启动子特征（图7），这种分化可能反映不同IS元件对转座效率的差异化调控策略。

转座的功能元件需求
缺失实验表明A盒、B盒和3'-REP序列对环化至关重要（图8）。值得注意的是，当A盒或B盒关键位点突变时，转座酶会转而利用侧翼NotI位点的AG进行异常重组，揭示转座酶对末端二核苷酸的严格识别是环化反应的核心决定因素。

这项研究首次完整描绘了ISPpu9通过形成多样化环状中间体实现模块化转座的分子路径。其发现具有三重重要意义：在机制层面，阐明了IS110家族中非典型成员的转座调控模式；在进化层面，揭示了小RNA作为可移动元件参与基因组重塑的新途径；在应用层面，为合成生物学提供了可编程的DNA重组工具。特别值得注意的是，ISPpu9与ssr9的共生关系为理解细菌基因组中"自私基因"的传播策略提供了鲜活案例，这种由转座酶驱动的模块化重组机制可能普遍存在于微生物基因组中。