基于AlphaFold2多聚体虚拟下拉技术的大丝氨酸重组酶同源重组方向性因子的鉴定与应用

本研究针对大丝氨酸重组酶(LSR)系统中重组方向性因子(RDF)鉴定困难的问题，创新性地采用AlphaFold2-multimer虚拟下拉技术，成功预测并验证了6个新型RDF的功能。该研究不仅揭示了RDF与整合酶在DBD2-CC连接区的保守结合模式，更为合成生物学和基因组编辑提供了宝贵的工具资源，相关成果发表于《Nucleic Acids Research》。

　　

在基因组编辑领域，大丝氨酸重组酶(LSR)家族因其简单的系统组成和高度定向的DNA重组能力备受关注。这些由溶原性噬菌体编码的分子剪刀，仅需整合酶和两个短DNA位点(attP/attB)就能完成基因组整合。然而其反向重组——切除反应却需要神秘的"交通警察"：重组方向性因子(RDF)来启动。长期以来，RDF的鉴定犹如大海捞针，既缺乏序列保守性，又与整合酶基因缺乏共线性，严重制约了LSR系统在合成生物学中的应用潜力。

芝加哥大学和利物浦约翰摩尔大学的联合研究团队另辟蹊径，将人工智能与实验验证完美结合。研究人员利用AlphaFold2-multimer算法开发出"虚拟下拉"技术，成功预测了43个LSR的潜在RDF，并实验验证了其中6个新型RDF的功能。这项发表于《Nucleic Acids Research》的研究揭示，尽管RDF结构千变万化，但它们都倾向于结合在整合酶DBD2与卷曲螺旋(CC)的连接区域，这种趋同进化现象为理解蛋白质相互作用提供了新视角。

研究团队采用多管齐下的技术路线：首先通过ESM-Fold预测LSR结构并截取DBD2结构域作为"诱饵"；运用LocalColabFold进行虚拟下拉筛选；结合pTM和ipTM评分系统评估预测可靠性；最后通过体内外重组实验验证功能。特别设计的"倒置启动子报告系统"巧妙地将重组效率转化为荧光信号，使结果一目了然。

研究结果呈现四大亮点：

1. 结构预测验证：AlphaFold2准确重现了已知LSR-RDF复合物结构，如SPbeta系统，为方法可靠性奠定基础。预测显示RDF虽结构各异，但都靶向DBD2-CC连接区，

   

2. 虚拟下拉筛选：从98个LSR中成功预测43个RDF，命中率达60%。如图3所示，通过pTM/ipTM评分可有效区分真假阳性。

   

3. 实验验证：Nm60、Bt24等6个系统的RDF功能得到确认，能特异性激活attL x attR重组并抑制attP x attB反应。图6的荧光报告系统直观展示了这一调控效应。

   

4. 机制启示：RDF通过结合DBD2-CC连接区改变CC构象，从而调控重组方向性。这种"分子开关"机制在不同系统中呈现趋同进化特征。

这项研究的科学价值体现在三个维度：方法学上，建立了RDF鉴定的高效流程；理论上，揭示了蛋白质相互作用的趋同进化规律；应用上，极大丰富了基因组编辑工具箱。特别是对合成生物学而言，新鉴定的正交LSR-RDF对为构建复杂遗传电路提供了模块化元件。正如作者指出，未来可基于这些发现设计合成RDF或改造整合酶，实现更精准的基因组操作。该研究也为AI辅助蛋白质相互作用研究树立了典范，其方法论可推广至其他蛋白复合体的发掘与表征。