基于CRISPR/Cas12a与DNAzyme的鼠疫耶尔森菌ELISA样可视化检测系统开发

这篇研究创新性地整合CRISPR-Cas12a系统、重组酶辅助扩增（RAA）和G-四链体（G4）DNAzyme技术，开发了一种低成本、高灵敏度的鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）可视化检测平台RCCD。通过筛选特异性基因CH57_3927，优化反应体系实现1拷贝/反应的检测限，在模拟临床样本中灵敏度与特异性均达100%，为资源有限地区的瘟疫防控提供了便捷高效的解决方案。

　　

检测原理
研究团队构建的RCCD检测平台通过三重技术联动实现信号转化：目标基因经RAA预扩增后，激活CRISPR/Cas12a系统的反式切割活性，降解G4单链DNA，使其无法与血红素（hemin）结合形成具有过氧化物酶活性的G4/hemin DNAzyme，从而抑制ABTS^2–显色反应。阳性样本呈无色透明，阴性样本则因完整的G4催化作用显现蓝绿色，实现肉眼可辨的ELISA样批量检测。

特异性基因筛选
利用Mauve软件比对耶尔森菌属基因组，筛选出仅存在于鼠疫耶尔森菌的保守基因CH57_3927（核苷酸位置4338643-4339629）。BLAST验证显示该序列在81株鼠疫菌中高度保守，且与近缘菌种无交叉，为后续检测奠定特异性基础。

CRISPR系统优化
针对CH57_3927设计12条crRNA，通过实时荧光分析筛选出效率最高的crRNA2（阳性/阴性斜率比10.85）。Cas12a浓度优化至111 nM，G4浓度定为0.25 μM时，显色对比最显著。实验证实ABTS显色优于TMB，2.5 μM hemin即可实现清晰判读，而G-rich ssDNA-4序列（TGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA）的切割效率最佳。

RAA扩增体系建立
设计14组引物对筛选出F2/R6组合，其扩增效率与荧光信号强度显著优于其他组合。但RAA体系中的DTT还原剂会抑制后续显色，通过添加35 mM H₂O₂中和干扰，并将RAA产物添加量优化至0.25 μL/反应，实现体系兼容。

性能验证
灵敏度测试显示该方法可检测低至1拷贝/反应的鼠疫菌DNA。特异性实验中，8种耶尔森菌属及6种常见病原菌（如大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌等）均未出现交叉反应。在30拷贝/μL的模拟血样检测中，15份加标样本全部检出，15份阴性样本无误判，灵敏度与特异性均达100%。

技术优势与局限
相较于依赖荧光标记ssDNA报告基或侧流层析试纸条的传统CRISPR检测，该平台成本降低80%，且支持96孔板批量操作。但G4结构致密导致反应需2小时，未来拟探索分裂式G-三链体提升效率。目前缺乏真实临床样本验证，需进一步评估复杂基质中的稳定性。

应用前景
该技术突破传统检测对昂贵设备的依赖，单台恒温设备即可完成全流程，特别适合非洲等疫区贫困地区的现场筛查。研究者指出，通过更换引物与crRNA设计，该平台可快速适配其他病原体检测，为传染病防控提供模块化解决方案。