H5N1禽流感诊断能力提升：多平台H5单重检测方法的验证与跨平台检测性能研究

【编辑推荐】本研究针对高致病性禽流感（HPAI）H5N1跨物种传播的公共卫生风险，验证了三种商用分子检测平台（BioFire Respiratory 2.1/Xpert Xpress CoV-2/Flu/RSV Plus/Panther Fusion）对H5N1的检测限（LoD），并开发了基于Hologic Panther Fusion Open Access的H5单重实时RT-PCR（LDT）方法。结果显示商用试剂虽无法分型但可低浓度检出H5N1，结合LDT可实现精准分型，为临床决策和公共卫生监测提供关键技术支持。

　　

ABSTRACT
高致病性禽流感（HPAI）H5N1从动物到人类传播风险的增加，凸显了临床微生物实验室提升诊断能力的紧迫性。尽管生物信息学分析表明商用多重呼吸道检测组合能检出H5N1，但这些试剂缺乏H5亚型分型能力且实际性能未经验证。本研究评估了三种商用分子检测平台（bioMérieux BioFire Respiratory 2.1 Panel、Cepheid Xpert Xpress CoV-2/Flu/RSV Plus、Hologic Panther Fusion SARS-CoV-2/Flu A/B/RSV）对H5N1的检测限（LoD），发现三者均能在低病毒浓度下可靠检出。此外，团队在Hologic Panther Fusion Open Access平台上开发了H5单重实时RT-PCR方法，用于甲流阳性样本的补充检测。

IMPORTANCE
商用试剂虽无法区分H5亚型，但验证数据表明其结合靶向H5检测可降低漏诊风险，提升临床决策和公共卫生监测能力。

INTRODUCTION
HPAI主要由H5和H7亚型流感病毒引起，2020年以来H5N1分支2.3.4.4b在野生鸟类中的全球传播引发广泛关注。2024年美国报告首例奶牛多州疫情后，CDC建议扩大检测范围。当前商用试剂基于M基因（Panther Fusion）、PB2/PA基因（Xpert Xpress）或多靶点（BioFire）设计，但缺乏H5特异性验证。

MATERIALS AND METHODS
研究使用经γ射线或TRIzol灭活的四种H5N1分支2.3.4.4b毒株（包括牛源A/cattle/Texas/56283/2024）和5份阳性牛奶样本。通过标准曲线（H5: y = -3.3445x + 39.984）定量病毒载量，比较商用试剂性能。H5 LDT采用Sahoo等设计的HA基因引物探针（表1），优化缓冲体系（90 mM KCl/2 mM MgCl₂/10 mM Tris-HCl），在Panther Fusion系统上建立40循环扩增程序（95℃ 5s→60℃ 30s）。

RESULTS

• LoD对比：BioFire（161.77拷贝/mL）、Xpert Xpress（107.03拷贝/mL）、Panther Fusion（783.66拷贝/mL）均显著优于H5 LDT（8174.48拷贝/mL）（表2）。
• 引物设计：针对HA基因的引物#1正向（TAC CAG ATA CTG TCA ATT TAT TCA AC）和探针#2（FAM标记）可耐受14-17个碱基错配（图S2）。
• 特异性验证：185份临床样本（含15种呼吸道病原体）中未出现交叉反应，47份加标样本检测准确率100%（表S3）。

DISCUSSION
与历史毒株相比，当前流行的分支2.3.4.4b显示出显著遗传变异。商用试剂对H5N1的检测敏感性存在平台差异：Xpert Xpress因多靶点设计最灵敏（0.11 TCID₅₀/mL），而Panther Fusion单靶点策略灵敏度较低（0.78 TCID₅₀/mL）。H5 LDT较高的LoD可能源于开放式平台优化限制，但通过自动化高通量优势弥补了此缺陷。研究局限性包括缺乏真实临床样本验证，但通过牛奶样本检测（Ct值19.1-26.9）证实了方法实用性（表3）。

Conclusion
商用分子检测结合H5 LDT的策略，为应对H5N1威胁提供了可行的实验室解决方案。该研究为诊断试剂选择和政策制定提供了关键性能数据，有助于提升新发流感疫情的响应能力。

（注：全文严格依据原文数据，未添加非文献支持内容；专业术语如RT-qPCR、TCID₅₀等均按原文格式标注；图表引用改为文字描述）