LuIII 与 H-1 细小病毒唾液酸结合位点的结构解析及其溶瘤靶向应用价值研究

本文聚焦溶瘤原细小病毒的靶向机制，明确 LuIII、H-1PV 与 MVMp 均依赖 α2-3 连接唾液酸（SIA）作为受体，通过冷冻电镜（cryo-EM）解析了 LuIII 和 H-1PV 与糖受体的复合物结构，发现其共享独特结合位点且与 MVMp 不重叠。该研究为优化溶瘤病毒靶向效率提供了关键结构基础。

　　

文章内容归纳总结

摘要

溶瘤原细小病毒，包括 LuIII、H-1 细小病毒（H-1PV）和小鼠微小病毒原型株（MVMp），能够靶向并破坏癌细胞。宿主细胞靶向主要基于病毒对初级受体的识别与相互作用。此前研究表明，MVMp 和 H-1PV 可结合唾液酸（SIA）这一初级糖受体。本研究探讨 LuIII 是否也利用类似糖分子进行宿主细胞附着。糖阵列分析证实，α2-3 连接的 SIA 是三种病毒细胞结合的共同受体需求，并识别出三种特定聚糖。通过冷冻电镜（cryo-EM）解析了 LuIII 和 H-1PV 与糖复合物的结构，分辨率达 2.57-2.88?。结果显示，LuIII 和 H-1PV 在二十面体二重轴附近共享一个唾液酸识别口袋，该口袋邻近但不重叠于已知的 MVMp 唾液酸结合位点。主要衣壳蛋白（VP2）的结构差异集中在这些糖结合口袋周围，这一结构表型可能导致不同啮齿类原细小病毒的肿瘤杀伤效率差异。本研究为优化溶瘤病毒靶向效率的衣壳工程改造提供了理论基础。

引言

细小病毒科（Parvoviridae）是一类小型单链 DNA 病毒，其线性基因组包裹在无包膜的 T=1 二十面体衣壳中。在原细小病毒属（Protoparvovirus）中，部分病毒虽以小鼠和其他啮齿类为自然宿主，却对人类肿瘤具有内在溶瘤活性，包括 LuIII、H-1PV 和 MVMp，且对人类无致病性。这些病毒可自主复制，但依赖 S 期宿主辅因子进行病毒 DNA 合成、转录和翻译。癌细胞中上调的多种蛋白有助于调控病毒基因表达，因此溶瘤原细小病毒优先感染转化细胞或肿瘤来源细胞，诱导凋亡并激活抗肿瘤免疫。

原细小病毒基因组约 5.2kb，编码三种非结构蛋白（NS1、NS2、SAT）和两种衣壳蛋白（VP1、VP2）。60 个 VP1 和 VP2 以约 1:10 的比例自组装成 T=1 衣壳，含基因组的颗粒中 VP2 的 N 端被切割产生 VP3，形成 VP1:VP2:VP3 约 1:1:10 的比例。VP1 的 N 端前 142 个残基（VP1u）含磷脂酶 A2（PLA₂）结构域，对感染性至关重要，但结构研究仅可视化了 VP2（约从残基 38 开始），其余 N 端因柔性或构象多样未被解析。MVMp、H-1PV 和 LuIII 的衣壳结构具有动物原细小病毒的共同特征，包括五重轴通道、三重轴突起、二重轴凹陷及围绕五重通道的峡谷，且 2/5 壁将二重轴凹陷与邻近五重峡谷分隔。VP2 的核心衣壳结构保守（含 α 螺旋和八链反平行 jelly-roll 基序），但表面可变区（VRs）的序列和结构多样性决定了抗体结合位点、受体结合位点及病毒嗜性。

MVMp 和 H-1PV 通过识别含负电荷末端唾液酸（SIA）的受体启动细胞结合，但多数病毒（包括 H-1PV、猪细小病毒（PPV）、犬细小病毒（CPV）、猫泛白细胞减少症病毒（FPV））的衣壳结合残基尚不明确，目前仅 MVM 和 CPV 的受体结合位点通过突变验证得以完全定位。MVMp 和免疫抑制株（MVMi）均识别 α2-3 连接的唾液酸，尤其是人类细胞中常见的 N - 乙酰神经氨酸（Neu5Ac）。H-1PV 的细胞识别和溶瘤作用与层粘连蛋白 γ1 的唾液酸依赖机制相关，而 MVMp 的唾液酸结合于二重轴凹陷的空腔中。VP2 残基的差异影响 MVM 的毒力、嗜性和宿主范围，H-1PV 中同源残基的替换表明细胞结合受特定氨基酸调控，但 LuIII 的糖受体识别及 H-1PV 与唾液酸相互作用的精确衣壳位点仍不明确。

细胞表面的糖受体由碳水化合物通过 α 或 β 糖苷键连接形成，唾液酸的 N - 乙酰基、羟基等功能基团修饰增加了复杂性。糖表达谱因物种、细胞类型及疾病（如癌症）而异。鉴于 LuIII、H-1PV 和 MVMp 具有相似的红细胞凝集能力且常感染相同细胞类型，且 MVMp 的唾液酸结合口袋残基高度保守，推测三者可能利用相同或相似受体。本研究通过糖阵列筛选和体外细胞结合实验，结合冷冻电镜解析 LuIII 和 H-1PV 与特定糖的复合物结构，揭示了它们与 MVM 不同的糖受体结合位点。

结果

1. 糖阵列筛选表征 LuIII 和 H-1PV 的糖识别特性
   采用 Consortium for Functional Glycomics（CFG）阵列（Version 4.1）对 LuIII 衣壳进行筛选，在 465 种糖中识别出 6 种目标糖，相对荧光单位（RFU）在 600-1750 之间，与其他细小病毒的糖结合信号一致。LuIII 优先结合含 α2-3 连接唾液酸（3'SIA）的线性表位，包括 s (LN)₂（Glycan 293）、s(LN)₃（Glycan 256），其中含唾液酸 Lewis^x（s(Le^x)）基序的 Neu5Acα2-3Galβ1-4 (Fucα1-3) GlcNAc（Glycan 253）信号最强。s (Le^x) 是 s (LN) 的岩藻糖修饰形式，在癌细胞中上调。LuIII 还识别含 GalNAc 或 Glc 修饰的唾液酸化基序，但不识别 α2-6 连接唾液酸（6'SIA）、多唾液酸化 Neu5Acα2-8Neu5Ac 基序，且 Gal 和 GlcNAc 的硫酸化会抑制结合。

H-1PV 采用 CFG 阵列（Version 3.1）筛选，在 377 种糖中识别出 5 种结合目标，同样优先识别 s (Le^x) 和 s (LN) 基序，其中 s (Le^x)₃（Glycan 227）信号最强（RFU=5574）。H-1PV 结合的糖均含至少一个 3'SIA（除 Glycan 122 含 6'SIA 外），且不结合多唾液酸化链或末端为 Gal、Fuc 等的糖链。

1. LuIII、H-1PV 和 MVM 共享唾液酸受体
   为直接比较结合偏好，在含 23 种糖（包括 7 种末端唾液酸的非分支糖）的同一阵列中筛选三种病毒。结果显示，LuIII 和 H-1PV 识别所有末端 3' 唾液酸化糖，而 MVM 仅识别其中两种；仅 LuIII 和 H-1PV 识别含 s (Le^x) 基序的 Glycan 7。与 CFG 阵列结果不同，三种病毒均识别多种 6' 唾液酸化糖，且 LuIII 和 H-1PV 结合多唾液酸化 GD2（Glycan 173）。此外，MVM 结合合成肝素 I 和天然肝素 XIV，而 LuIII 和 H-1PV 不识别任何肝素，H-1PV 还检测到与艾杜糖醛酸单糖的相互作用。

流式细胞术实验显示，荧光标记的 LuIII、H-1PV 和 MVM 衣壳可特异性结合表达末端唾液酸的 Pro-5 中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，而不结合末端为半乳糖（Gal）的 Lec-2 细胞或末端为 N - 乙酰葡糖胺（GlcNAc）的 Lec-8 细胞，证实唾液酸是三者的共同受体。

1. 唾液酸结合于 LuIII 衣壳的二十面体二重轴壁
   将 LuIII 衣壳与 s (LN)₃或 s (Le^x)₂复合后进行冷冻电镜分析，分别基于 56,731 和 38,079 个衣壳颗粒，获得分辨率为 2.66? 和 2.88? 的结构。与未结合状态的 LuIII 结构（PDB ID: 6B9Q）相比，复合物在三重轴突起底部的浅腔中出现额外密度，该区域位于二重轴凹陷和 2/5 壁周围。s (LN)₃的 3'SIA 密度在 2.0σ contour 水平清晰可见，后续半乳糖（Gal）和 GlcNAc 密度在 1.5σ 和 1.0σ 水平可见，远端糖链无明显密度故未建模。

LuIII 与唾液酸的相互作用包括 C1 羧酸盐与 R375 的盐桥，以及与 R394、T396 的多个氢键。PDBePISA 分析显示，13 个残基部分或完全被配体掩埋，主要位于单个 VP 单体中（R375、Y378 等），总掩埋表面积（BSA）约 200?²，半乳糖和 GlcNAc 贡献约 20?²。结合与未结合状态的 LuIII 结构叠加，Cα 根均方偏差（RMSD）为 0.35?，仅可变区 II（VRII，残基 158-164）和部分侧链构象有微小变化，与糖结合区域无关。

1. H-1PV 与 LuIII 共享唾液酸识别口袋
   H-1PV 衣壳与 s (Le^x)₂复合后的冷冻电镜结构分辨率为 2.57?，未结合状态为 2.59?。与 X 射线晶体结构（PDB ID: 4G0R）相比，冷冻电镜结构的 DE 环 apex 构象偏移达 4.5?，N 端额外解析 3 个氨基酸，HI 环（残基 518-524）侧链构象差异显著（局部 RMSD 达 1.06?），部分组氨酸残基（如 65、86 等）因密度清晰得以明确建模。

H-1PV-s(Le^x)₂复合物在与 LuIII 相同的位置（二重轴凹陷和 2/5 壁周围）出现额外密度，末端唾液酸和连接的半乳糖在 1.1σ 水平可见，后续 GlcNAc 在 0.8σ 以下可见，分支岩藻糖及远端糖链无密度未建模。H-1PV 与唾液酸的相互作用包括 C1 羧酸盐与 R381 的盐桥，以及与 R381、R401、T403 的氢键，E400 还与唾液酸 C4 羟基形成潜在氢键。12 个残基部分或完全被糖掩埋，总 BSA 约 180?²（唾液酸）和 30?²（半乳糖）。

讨论

唾液酸结合能力在细小病毒衣壳中普遍存在，目前已在细小病毒亚科三个属的 16 种病毒中发现，包括原细小病毒属的 MVM、CPV、H-1PV、LuIII 等。唾液酸广泛存在于脊椎动物细胞膜，常位于 N - 糖链、O - 糖链和鞘糖脂的末端分支，其中 s (Le^x) 和 s (LN) 等特定唾液酸化糖在转移性癌症中上调，与不良预后相关。LuIII、H-1PV 和 MVM 对这些糖的识别能力，解释了它们对胶质瘤、黑色素瘤等肿瘤的高效靶向性。

糖阵列结果显示三者均识别 α2-3 连接唾液酸，但 H-1PV 在筛选中也识别 α2-6 连接唾液酸，阵列间差异可能源于糖固定的柔性连接臂不同。α2-3 和 α2-6 连接唾液酸的识别差异可能影响病毒对疾病进展阶段的靶向，如胶质瘤或黑色素瘤。

结构分析表明，LuIII 和 H-1PV 在三重轴基部和 2/5 壁附近共享一个唾液酸结合位点，而 MVM 的结合位点位于约 9? 外的二重轴凹陷中，三者的结合位点由 2/5 壁残基差异决定。LuIII 和 H-1PV 的结合残基（如 LuIII 的 R375/R394/T396 与 H-1PV 的 R381/R401/T403）高度保守，但周边残基（如 LuIII 的 V575 与 H-1PV 的 D581）的疏水性和电荷差异可能影响结合动力学，导致 H-1PV 在糖阵列中信号更强。

MVM 的唾液酸结合位点独立于 LuIII 和 H-1PV，但三者均结合多种 α2-3 唾液酸化糖，表明原细小病毒的唾液酸结合能力经多次进化产生，类似腺相关病毒（AAV）的多个唾液酸结合位点。犬细小病毒（CPV）的唾液酸结合残基（R377、E396、R397）与 LuIII/H-1PV 的同源残基功能相似，但周围可变区结构差异可能导致糖链构象不同。

总结与结论

本研究阐明了原细小病毒属另外两个成员的糖受体识别机制。LuIII 对 s (Le^x) 和 s (LN) 的结合能力解释了其对胶质瘤和黑色素瘤的高效靶向性；H-1PV 可穿过血脑屏障靶向胶质瘤，这在临床试验中已得到证实。三者均通过 α2-3 连接唾液酸结合，但结合位点不同，原细小病毒的唾液酸相互作用依赖保守残基（如 LuIII/H-1PV 的 R375/R381、R394/R401、T396/T403），周边可变区结构差异导致结合效率和嗜性不同。本研究为基于结构的溶瘤病毒衣壳改造提供了关键靶点，有望推动高效肿瘤靶向溶瘤疗法的开发。<|FCResponseEnd|>