流感病毒在质膜上的感染受限于脂质组成：胆固醇有序相结构对膜融合效率的调控机制

这篇研究揭示了流感病毒(IAV)在质膜(PM)与内体膜融合效率差异的分子机制。通过单病毒含量混合实验和质膜囊泡(PMV)模型，发现质膜液态有序相结构（富含胆固醇和鞘磷脂）显著抑制IAV膜融合，而内体富集的磷脂BMP仅部分缓解这种抑制。胆固醇耗竭使质膜流动性增加，将IAV在肺上皮细胞的感染效率提升2.4倍，为理解病毒组织嗜性提供了新的膜生物学视角。

　　

流感病毒在质膜上的感染受脂质组成限制

ABSTRACT
许多包膜病毒通过内体膜融合进入细胞，这引发了一个关键问题：为何内体途径比直接质膜融合更具感染优势。研究发现，流感A病毒(IAV)在A549细胞的质膜融合导致感染效率降低4.5倍。通过开发单病毒含量混合检测系统，揭示质膜融合效率比含内体磷脂BMP的脂质体低6倍。令人意外的是，向质膜囊泡(PMV)补充BMP并不能完全恢复融合效率，表明质膜缺乏BMP并非限制融合的唯一因素。胆固醇耗竭可增强脂质混合速率并降低膜有序性，而适度降低肺上皮细胞的胆固醇水平能使质膜融合介导的感染提升2.4倍。这表明内体适应的流感病毒在质膜的融合受到液态有序相质膜结构的限制。

IAV forced fusion at the plasma membrane
实验采用X-31(H3N2)流感病毒株，通过两种途径感染A549肺上皮细胞：经典内体途径与酸性pH触发的强制质膜融合(FFPM)。免疫染色显示，FFPM的感染效率比内体途径低4.5倍，且不受病毒载量影响。弱碱NH₄Cl完全抑制感染，证实内体酸化是关键触发因素。这一差异提示质膜本身存在限制融合的膜特性。

Developing an assay for detecting viral content mixing with PMVs
为解决质膜复杂性研究的难题，团队创新性地建立质膜囊泡(PMV)模型。通过冻融循环将淬灭浓度的钙黄绿素(calcein)载入PMV，结合微流控技术实现单病毒融合观测。电镜显示PMV保留典型球形结构，纳米粒子追踪分析证实其粒径分布均一。值得注意的是，离子霉素处理使PMV外叶磷脂酰丝氨酸(PS)暴露增加2.5倍，证实其保留了质膜不对称性特征。

IAV lipid and content mixing with liposomes vs PMVs
同步检测Texas Red标记的病毒脂质混合与calcein含量混合发现：IAV与含20 mol% BMP的脂质体融合时，内容混合效率比PMV高6倍。钙黄绿素信号释放曲线分为三类：I型（快速泄漏）、II型（缓慢衰减）和III型（稳定升高），其中80%事件伴随内容物泄漏，与HA介导的膜重组特征一致。这表明质膜环境显著抑制融合孔稳定性。

Manipulating the PMV lipid composition
通过甲基-α-环糊精(MαCD)递送BMP至PMV后，虽然免疫染色证实BMP成功整合（信号增强9.3倍），但内容混合效率未显著改善。相反，用甲基-β-环糊精(MβCD)去除14%胆固醇后，脂质混合动力学显著加快（P<0.05），且Laurdan荧光偏振(GP)值降低，提示膜流动性增加。有趣的是，补充鞘磷脂(SM)对融合无显著影响，反映质膜外叶SM已处于饱和状态。

PMV membrane perturbations affect membrane order
Laurdan光谱分析揭示关键发现：PMV的GP值显著高于BMP脂质体，证实其液态有序相特性。胆固醇耗竭使GP值降低14%，而BMP插入产生类似效果。这种膜流动性变化与脂质混合速率提升直接相关，暗示液态有序相结构通过影响膜弯曲刚度阻碍融合钉形成。

IAV forced fusion at the plasma membrane of cholesterol-depleted cells
在细胞层面验证时，1 mM MβCD处理使A549细胞质膜融合感染率提升2.4倍。但5 mM处理因细胞毒性产生反效果，这与胆固醇对病毒受体结合的复杂调控一致。该结果将模型系统发现与生理环境相关联，证实质膜胆固醇微结构是限制IAV感染的关键屏障。

DISCUSSION
研究突破性地揭示：内体适应的流感病毒在质膜的融合受限主要源于膜物理特性差异，而非传统认知的BMP缺失。液态有序相结构通过双重机制发挥作用——既抑制初始脂质混合动力学，又阻碍融合孔扩张。这为理解病毒进化中膜适应性选择提供了新框架，并暗示质膜可能普遍限制内体适应病毒的入侵。未来研究可拓展至SARS-CoV-2等pH依赖性病毒，探索膜有序性调控作为广谱抗病毒靶点的潜力。

MATERIALS AND METHODS
技术体系包含三大创新：1）PMV制备采用25 mM PFA/2 mM DTT诱导出芽，保留天然脂质不对称性；2）微流控单病毒检测系统实现毫秒级pH切换与多参数同步采集；3）C-Laurdan GP值定量建立膜物性与融合效率的定量关联。统计采用双重验证：KS检验评估事件分布差异，跨流道Bootstrap秩和检验克服生物样本异质性，确保结论稳健性。