基于DNA和mRNA-LNP技术的H5N1亚型禽流感病毒双抗原疫苗开发及保护机制研究

本期推荐：本研究针对高致病性H5N1禽流感病毒（clade 2.3.4.4b）开发了创新的DNA和mRNA-LNP疫苗，通过单开放阅读框（ORF）同时表达血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）蛋白。实验证明该双抗原策略在小鼠模型中诱导强效中和抗体，完全抵御致死剂量病毒攻击，为应对人畜共患流感威胁提供了快速响应方案。

　　

ABSTRACT
针对当前在美国牛群和家禽中流行的2.3.4.4b分支高致病性H5N1禽流感病毒，研究团队开发了新型核酸疫苗。与传统季节性流感疫苗相比，基于mRNA-脂质纳米颗粒（LNP）的疫苗具有快速适应病毒变异的优势。该研究采用单开放阅读框设计，使A/Texas/37/2024毒株的HA和NA蛋白能通过同一DNA或RNA分子表达。小鼠实验显示，这种双抗原表达方式可激发针对两种蛋白的强效免疫反应，在致死剂量病毒攻击下实现完全保护。

INTRODUCTION
2024年初，2.3.4.4b分支H5N1病毒在奶牛群中出现跨物种传播，B3.13基因型病毒已感染17个州的950多个牛群。值得注意的是，A/Texas/37/2024毒株能从感染奶牛的工人体内分离，表明其具备感染人类的能力。传统灭活疫苗生产周期长，而核酸疫苗平台具有快速响应优势。研究团队此前开发的季节性流感mRNA-LNP四价疫苗已证实可同时表达多种糖蛋白，本研究将该技术拓展至人畜共患流感病毒防控。

RESULTS
基因构建与表达验证
通过Furin和PTV-2A切割位点连接NA和HA基因的质粒转染293T细胞后，免疫荧光和功能实验证实两种蛋白能正确表达并保持活性。NA保留神经氨酸酶活性，HA具备pH依赖性膜融合能力，为后续疫苗设计奠定基础。

DNA疫苗免疫原性
电穿孔递送NA-F2A-HA质粒的小鼠产生高滴度HA/NA结合抗体。NA抑制试验（NAI）显示抗体能阻断酶活性，微量中和试验（MN₅₀）证实对A/Texas/37/2024 NanoLuc报告病毒的中和能力。攻毒实验显示，免疫组小鼠肺部病毒载量降低100倍，炎症因子CXCL-10、IFN-β和TNF-α水平显著下降，全部存活且无体重减轻。

mRNA-LNP疫苗验证
采用通用型LNP包裹NA-F2A-HA mRNA后，小鼠血清抗体滴度较DNA疫苗提高10倍。血凝抑制（HAI）效价达1:320，NA抑制活性提升8倍。致死剂量攻毒后，所有免疫组小鼠肺部未检出活病毒（检测限10 PFU/mL），病理切片显示肺部浸润轻微，而对照组全部在5天内死亡。

DISCUSSION
该研究首次证实DNA/mRNA双平台在H5N1防控中的协同价值：DNA疫苗适合畜牧业大规模接种，mRNA-LNP则适用于人类应急接种。特别值得注意的是，NA抗体的加入显著提升保护效果，这与既往研究认为NA免疫可减轻疾病严重程度的结果一致。研究局限性在于尚未在雪貂等更接近人类的模型验证，且长期免疫持久性需进一步评估。

MATERIALS AND METHODS
关键技术包括：使用GenVoy离子化脂质制备mRNA-LNP（封装效率>90%），通过电穿孔递送50μg DNA疫苗，采用qRT-PCR定量肺部病毒RNA（探针靶向HA基因）。所有活病毒实验在BSL-3实验室完成，使用SPF级C57BL/6小鼠，攻毒剂量为200 PFU WT病毒。统计学分析采用Kruskal-Wallis检验和Benjamini-Hochberg FDR校正。

该研究为应对H5N1潜在大流行提供了双重技术路径，其模块化设计可快速适配新发病毒株，展现核酸疫苗在传染病防控中的核心优势。