人源PrP E219K：实现人类朊病毒高效RT-QuIC扩增及株型鉴别的新一代底物

这篇研究推荐人源PrP E219K作为实时震动诱导转化（RT-QuIC）的新型底物，可高效扩增包括散发性克雅病（sCJD）和变异型克雅病（vCJD）在内的多种人类朊病毒株型。通过分析扩增动力学滞后期（lag time），该底物能直接区分vCJD与所有测试的sCJD亚型（如MM1/MV1/VV2等），检测灵敏度达飞克级（fg），且无自发聚合干扰。这一突破为朊病毒生前诊断和株型分型提供了重要工具。

　　

ABSTRACT
哺乳动物朊病毒疾病是由宿主编码的朊蛋白（PrP^{CSc）引发的致命神经退行性疾病。本研究评估了人类PrP E219K（第219位谷氨酸被赖氨酸取代的自然多态性）作为RT-QuIC底物的性能。该底物成功扩增了tg650转基因小鼠脑匀浆和患者样本中的6种sCJD株型及vCJD株型，扩增滞后期分别为3-36小时（sCJD）和11-35小时（vCJD），检测范围覆盖5-8个对数稀释梯度。值得注意的是，通过统计学分析扩增滞后期，可明确区分vCJD与所有测试的sCJD亚型。}

INTRODUCTION
传染性海绵状脑病（TSE）影响包括人类在内的多种哺乳动物，其中散发性克雅病（sCJD）占人类病例的80%。PrP^Sc的蛋白酶抗性核心（PrP^res）是疾病关键标志物，其电泳图谱（21 kDa的1型或19 kDa的2型）与PRNP基因129位密码子（M/V）多态性共同定义了至少7种sCJD分子亚型。现有诊断技术中，RT-QuIC因其高灵敏度、实时荧光检测（硫磺素T标记）和生物安全性优势，逐渐成为临床主流，但其在vCJD检测和株型鉴别方面仍存在局限。

MATERIALS AND METHODS
研究使用表达人类PrP M129等位基因的tg650小鼠脑匀浆及患者脑组织样本。通过Western blot定量PrP^res水平后，采用含100 μg/mL重组PrP E219K的RT-QuIC反应体系（46°C振荡培养），以硫磺素T荧光信号实时监测扩增过程。扩增曲线通过MATLAB拟合，计算滞后期、斜率等参数，并利用Spearman-K?rber方法测定半数 seeding dose（SD₅₀）。统计分析采用线性模型与置换检验相结合的方法。

RESULTS

1. tg650传代sCJD朊病毒的扩增
   PrP E219K可高效扩增所有测试株型（MM1/MV1/VV1/MM2-c/MV2/VV2），扩增范围达5-7个对数梯度。其中tg650-MM1灵敏度最高（SD₅₀=7.91×10⁸/mg脑组织），而tg650-MM2-c滞后期最长（5-36小时）。统计证实该底物可区分表型相似的tg650-MM1与tg650-MV1（P=0.0195）。

2. vCJD的特异性鉴别
   tg650-vCJD扩增滞后期（11-31小时）显著长于sCJD株型（P<0.0001）。患者vCJD样本同样显示17-35小时的特征性滞后期，与sCJD形成鲜明对比。

3. 患者样本直接检测
   除VV1患者样本（仅2个对数扩增范围）外，其余sCJD亚型均实现5-8个对数扩增。vCJD与sCJD的AUC分析显示显著差异（P<0.0001），且MM2-c与其他亚型可明确区分。

DISCUSSION
PrP E219K解决了现有RT-QuIC底物的三大痛点：

1. 克服vCJD检测灵敏度低的瓶颈（检测限30 fg/反应）
2. 通过滞后期分析实现单次实验区分vCJD与sCJD
3. 避免自发聚合导致的假阳性

该底物对罕见亚型（如VV1）的检测性能仍需更大样本验证，但其在脑脊液等外周样本中的应用潜力已为朊病毒早期诊断开辟新途径。研究首次证实，单一底物即可同时满足"高灵敏度"与"株型鉴别"双重需求，这对临床诊疗和疫情监测具有里程碑意义。