ABSTRACT
Epstein-Barr 病毒（EBV）感染与多种恶性肿瘤密切相关，包括鼻咽癌（NPC）、Burkitt 淋巴瘤和某些胃癌，但 EBV 感染内皮细胞（ECs）的潜力及其后续病理意义仍知之甚少。本研究通过对 99 例 NPC 临床样本（原发肿瘤）的分析表明，内皮细胞中 EB 病毒编码小 RNA（EBERs）阳性与 N 分期（淋巴转移，P < 0.05）、M 分期（远处转移，P < 0.01）和晚期临床分期（P < 0.01）显著相关，而免疫谱分析显示 EBERs 阳性内皮细胞患者的 B 细胞比例同时降低（P < 0.01）。通过采用 EBV 颗粒感染、Transwell 共培养以及与 EBV 阳性 Akata 和 Raji 细胞直接接触系统的综合体外模型，研究观察到人类淋巴内皮细胞主动内化受感染的淋巴细胞，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）证实 EBV 癌基因（EBNA1、LMP1 和 LMP2）的表达 —— 特别是在直接接触条件下 —— 同时内吞相关基因 Rab5a 和 EHD1 显著上调，且有吞噬体形成的超微结构证据。这些发现共同表明，吞噬性摄取 EBV 感染的淋巴细胞或其成分可能是内皮细胞的主要感染机制，可能建立促进肿瘤进展和不良临床结局的免疫抑制微环境，但其确切分子通路仍需进一步阐明。
IMPORTANCE
鼻咽癌标本的临床研究确定 EBERs 阳性内皮细胞是具有临床意义的生物标志物，与淋巴转移（P < 0.05）、远处转移（P < 0.01）和晚期肿瘤分期（P < 0.01）有密切相关性，而对受影响患者的免疫谱分析显示 B 细胞群同时减少（P < 0.01），这些共同表明了系统性免疫调节状态。此外，整合活细胞动态成像、单细胞转录谱分析和超微结构电子显微镜的实验方法提供了令人信服的证据，表明内皮细胞对淋巴细胞的吞噬作用是 EBV 细胞进入并随后调节 NPC 肿瘤微环境的主要途径。
INTRODUCTION
鼻咽癌（NPC）是一种起源于鼻咽黏膜的独特上皮恶性肿瘤，与其他头颈部癌症相比，其病因、临床表现和治疗方法具有独特性。虽然环境和遗传因素参与其发病机制，但 EB 病毒（EBV）感染与之的强关联性仍是 NPC 的标志性特征，且有新证据表明核因子 -κB（NF-κB）信号通路的异常激活与其发展有关。除 NPC 外，EBV 在病因上还与多种恶性肿瘤相关，包括 Burkitt 淋巴瘤、Hodgkin 淋巴瘤、胃癌以及浆细胞淋巴瘤，甚至与多发性硬化等某些自身免疫疾病相关。值得注意的是，EBV 不仅驱动原发性肿瘤发生，还调控免疫抑制性肿瘤微环境，促进多种癌症类型的局部肿瘤进展和转移性扩散，包括 NPC、EBV 相关肝内胆管癌和 EBV 相关胃癌。
血管内皮由衬于血管和淋巴管内的特化扁平细胞组成，是调节循环与组织间物质交换的动态界面。在肿瘤微环境中，内皮细胞（ECs）的作用超越了经典的屏障功能，还积极参与淋巴和远处转移过程。虽然 EBV 主要通过已知机制靶向 B 淋巴细胞和上皮细胞，但新证据对内皮细胞抵抗 EBV 感染的传统观点提出了挑战。体外研究表明 EBV 能够感染人脐静脉内皮细胞，通过激活 NF-κB 通路促进细胞存活。临床观察进一步支持这一现象，在多种病理状态中发现了 EBV 感染的内皮细胞，包括艾滋病相关上皮样血管内皮瘤、系统性肉芽肿性动脉炎、冠状动脉炎，尤其是在 EBV 相关恶性肿瘤如某些胃癌和 NPC 中。
尽管有这些有趣的观察，EBV 与内皮细胞相互作用的关键空白仍未填补，特别是在 NPC 进展和患者结局中的临床意义方面。EBV 感染的内皮细胞在 NPC 免疫微环境中的功能影响及其作为预后生物标志物的潜力在很大程度上尚未被探索。本研究旨在通过系统研究 NPC 中 EBV 阳性内皮细胞的 prevalence、临床相关性和免疫学影响，重点关注其与疾病进展和患者生存结局的关系，以填补这些知识空白。
MATERIALS AND METHODS
Patients and tumor samples
本研究使用的石蜡包埋 NPC 组织标本包括 99 例新诊断 NPC 患者的原发肿瘤活检样本，均为 2021 年 4 月至 2022 年 9 月期间在广西医科大学附属肿瘤医院连续收集。原发性 NPC 病例的纳入标准为：（i）在本院进行初步诊断和活检；（ii）组织病理学证实为非角化性鳞状细胞癌；（iii）活检前未接受任何抗癌治疗（包括放疗、化疗、靶向治疗或免疫治疗）；（iv）有完整的临床资料和足够的组织样本。为保持分析的客观性，所有病理标本均通过分配与患者人口统计学无关的唯一识别码进行匿名化处理，连续组织切片进行盲法染色程序，并由不了解临床结局的病理学家进行独立病理评估。使用 Tissue Gnostics 全自动全景扫描系统（配备 Zeiss AXIO Imager.Z2 显微镜和 TissueFAXS 7.1.119 软件的赛默飞世尔科技）获取和分析病理标本的组织切片。
Serum sample processing and humoral immunity assessment
从未接受治疗的患者收集外周血样本，并在标准化条件下处理：样本在室温下凝固 30 分钟后分离血清。使用市售免疫比浊法检测试剂盒按制造商协议量化体液免疫标志物（IgG、IgM、IgA、C3 和 C4）水平，其中 IgG、IgM 和 IgA 检测使用广西康柏莱科技有限公司（中国南宁）的试剂盒，C3 和 C4 检测使用浙江美康生物科技股份有限公司的试剂盒。检测使用生化分析仪（ADVIA2400）（德国西门子生化）进行，根据每个检测生成的标准曲线确定分析物浓度。
Cellular immunity profiling by flow cytometry
收集未治疗患者的全血与流式抗体共孵育，然后通过流式细胞仪（美国贝克曼）检测总 T 淋巴细胞、辅助性淋巴细胞、抑制性淋巴细胞、自然杀伤（NK）细胞和 B 淋巴细胞的比例。试剂盒购自贝克曼库尔特公司。
Hematoxylin and eosin staining and in situ hybridization assay
按照标准化协议对 NPC 组织切片进行苏木精 - 伊红（H&E）染色和 EBV 特异性原位杂交（ISH），以评估血管结构和 EBV 感染状态。组织处理包括烘烤、通过梯度乙醇系列进行连续脱蜡和再水化。用酸性乙醇分化和氨水返蓝进行苏木精核染色后，切片进行胃蛋白酶消化以暴露核酸靶点，随后乙醇脱水并风干。为检测 EB 病毒编码小 RNA（EBERs），将地高辛标记的 EBERs 探针（30 μL / 切片）在湿盒中与切片杂交，然后与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育（1:200，30 分钟），再用 3,3'- 二氨基联苯胺显色（北京中杉金桥生物技术有限公司和北京奥立基因科技有限公司）。
所有染色切片由两名资深病理学家采用标准化评分标准进行盲法独立评估：EBV 阳性需有强核染色强度。血管识别依赖于 H&E 的特征形态学特征（内皮衬里和管腔结构），EBV 感染的内皮细胞定义为每个高倍视野（400×）中≥3 个形态学确认的内皮细胞存在共定位的 EBER 信号。临床分期（美国癌症联合委员会，第 8 版）和预后分级由不了解分子结果的研究者独立关联。有争议的病例由第三位病理学家裁决以达成共识，确保诊断准确性和可重复性。
Cells and viruses
本研究中使用的绿色荧光蛋白（GFP）标记的 Akata（Akata-GFP）细胞和 GFP 标记的 Raji（Raji-GFP）细胞由广西医科大学区域性高发肿瘤早期防治教育部重点实验室保存和维持在标准细胞培养条件下。人淋巴内皮细胞（HLECs）购自上海赛百慷生物技术有限公司。Akata-GFP 细胞在补充有 9.4% 胎牛血清和 0.6% 遗传霉素 418 溶液的 Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640 培养基中培养；Raji 细胞在补充有 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基中培养，而 HLECs 在补充有 5% 胎牛血清、1% 内皮细胞生长补充剂和 1% 青霉素 / 链霉素的内皮细胞培养基（ECM）（ScienCell Research Laboratories）中维持。所有细胞在 37°C、5% CO2的 humidified 培养箱中培养，并使用 0.25% 胰蛋白酶（Gibco）传代。
按照先前发表的 protocol，使用 Akata-GFP 细胞制备 EBV 悬液以生产 EBV。在使用抗 IgG 抗体（终浓度 100 μg/mL）诱导 Akata-GFP 细胞裂解和复制后 48 小时，通过超速离心收集含病毒的上清液。参考文献对病毒 DNA 进行定量分析。
Strategic modes of EBV infection in human lymphatic endothelial cells
采用三种不同的实验范式研究 HLECs 中的 EBV 感染机制：（i）如文献所述的直接病毒颗粒感染（MOI = 1,000）；（ii）Transwell 介导的与经 TPA（20 ng/mL）和丁酸钠（3 mM）诱导进入裂解期的 EBV 阳性淋巴瘤细胞（Akata/Raji）的间接共培养；（iii）与 EBV 阳性淋巴瘤细胞的直接细胞相互作用。对于直接病毒感染，将融合的 HLEC 单层（1.5 × 10?细胞 / 孔，80% 融合度）暴露于冰融的 EBV 储存液（在完全 ECM 中），轻轻振荡确保病毒均匀分布，随后孵育 72 小时，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，并用 RZ 裂解缓冲液处理以使用 RNAsimple 总 RNA 提取试剂盒提取 RNA。Transwell 系统在上室使用裂解期的 Akata-GFP 细胞（2 × 10?），下室使用 HLECs，在裂解前 48/72 小时更换培养基。对于直接细胞相互作用，将经裂解诱导的 Akata-GFP 细胞与 HLECs 共培养 72 小时，然后根据 Duensing 和 Watson 的报告 protocol，通过补体依赖的细胞毒性作用消除残留的淋巴瘤细胞。此外，随后对 CD21 进行 RT-qPCR 验证，以确认在从 HLEC 裂解物中提取 RNA 之前已有效清除残留细胞。所有感染条件均包括三次生物学重复和 EBV 阴性对照，裂解物储存在 - 80°C 用于下游分子分析。
Real-time fluorescence imaging of Akata cell-HLEC/Raji cell-HLEC interactions
将 Akata-GFP 细胞和 Raji 细胞诱导进入裂解复制期，严格洗涤（3× PBS）以去除诱导试剂，然后与 HLECs 在 37°C、5% CO2下共培养，使用 BioStation IM-Q 工作站进行活细胞成像，在共培养后立即开始同时采集明场和 GFP 荧光图像，每 10 分钟捕获一次，以动态监测细胞相互作用和潜在的 EBV 转移事件。
RT-qPCR detection of endocytosis- and EBV-related genes expressed in HLECs
各组 HLECs 经历上述 EBV 感染模式后，分别通过 RT-qPCR 检测内吞相关基因和 EBV 相关基因。简而言之，使用 Trizol 试剂从各组 HLECs 中提取总 RNA。通过 Nanodrop 2000 分光光度计测量 RNA 的纯度和浓度。通过逆转录从总 RNA 合成 cDNA，GAPDH 用作 RNA 的内参。按照制造商说明进行 RT-qPCR。反应条件如下：95°C 预变性 30 秒以激活 DNA 聚合酶，随后 40 个循环的 95°C 5 秒和 60°C 30 秒。生成熔解曲线分析以验证扩增产物的特异性。反应后，分析熔解曲线并记录 Ct 值。使用 2(-ΔΔCt)方法计算基因的相对表达水平。LMP1、LMP2A、EBNA1、CD21、Rab5a、Rab7a、EHD1 和 ARF6 的引物序列如表 1 所示。
Sample preparation for transmission electron microscopy
与 Raji 细胞共培养 48 小时后，将 HLECs 酶解分离，并通过连续固定、脱水和包埋步骤进行超微结构分析。初级固定使用 3% 戊二醛（溶于 0.1 M PBS）在 4°C 下进行≥2 小时，随后三次 PBS 洗涤（每次 10-15 分钟）。次级固定使用 1% 四氧化锇（溶于 PBS）在 4°C 下进行 1-2 小时，随后 PBS 冲洗。梯度脱水系列从冰浴的 50% 和 70% 乙醇开始（各 15 分钟，4°C），接着是 90% 乙醇和 90% 丙酮的 1:1 混合物，以及三次 100% 丙酮（各 15 分钟，室温）。将样本在丙酮和树脂的混合物（1:3）中逐渐渗透过夜，然后最终包埋在 618 环氧树脂中并逐步聚合（40°C/15 小时→48°C/12 小时→60°C/48 小时）。使用超薄切片机（德国 Leica EM UC）收集的超薄切片用醋酸铀和柠檬酸铅进行对比染色，然后使用透射电子显微镜成像。
Obtaining and processing single-cell transcriptome data
从 GEO 数据库下载 GSE120926 的单细胞表达矩阵、条形码和基因注释。使用 Seurat v.5.1.0 进行数据处理，基于两个标准进行细胞过滤：（i）检测到的基因少于 500 个；（ii）线粒体基因表达超过 20%。过滤后，使用 Seurat 的标准工作流程处理数据，包括计算 20 个主成分（通过主成分分析）和基于锚点的整合。以 0.2 的分辨率进行细胞聚类，并基于标记基因表达识别聚类。使用相同的分辨率对细胞类型进行进一步细分，使用 SingleR 作为参考手动优化免疫细胞注释。
Acquisition and processing of spatial transcriptome data
从 GEO 数据库获取 GSE206245 的 stereo-seq 单细胞表达矩阵和空间位置数据。使用 Seurat 的 SCTransform 函数对表达矩阵进行标准化。随后，利用注释的单细胞转录组数据通过 TransferData 函数对空间转录组数据进行注释。量化每个细胞的 EBV 基因表达水平，将表达大于零的细胞归类为 EBV 阳性，否则为 EBV 阴性。最后，计算 EBV 感染细胞的比例。
Statistical analysis
所有统计分析均使用 SPSS v.17.0（IBM，美国）进行。所有数据均使用 Student's t 检验进行分析。P 值 < 0.05 被认为具有统计学显著性差异。计数数据以频率和百分比表示，并通过 χ2 分析或 Fisher 精确检验进行分析。计量数据以均值 ± 标准差表示，正态分布的数据通过 F 检验或 t 检验进行分析。非正态分布的数据通过非参数检验或 Wilcoxon 秩检验进行分析。使用 Kaplan-Meier 方法估计生存函数，并使用对数秩检验（Mantel-Cox 检验）进行组间比较，绘制生存曲线并进行组间比较。
RESULTS
Association between EBV infection status and clinical characteristics and prognostic staging in NPC patients
在收集的 99 例 NPC 患者肿瘤活检样本中，93 例（93.9%）为 EBERs 阳性，6 例（6.1%）为 EBERs 阴性。EBERs 阳性和 EBERs 阴性患者在年龄、性别分布、肿瘤 - 淋巴结 - 转移（TNM）分类或临床分期方面未观察到显著差异。
Association between endothelial EBERs positivity and clinical stage of nasopharyngeal carcinoma
对 99 例 NPC 患者内皮细胞中 EBERs 状态的 ISH 分析显示，81 例（81.8%）为 EBERs 阴性内皮细胞，18 例（18.2%）为 EBERs 阳性内皮细胞。
对 NPC 患者临床特征与瘤周血管内皮细胞 EBV 感染状态之间关联的分析显示，EBERs 阳性组和 EBERs 阴性组在远处转移、临床分期和总体临床结局方面存在统计学显著差异。结果表明，EBERs 阳性组中 N3 期患者的比例显著更高（55.56%，18 例中的 10 例），而 EBERs 阴性组为 30.86%（81 例中的 25 例）。此外，EBERs 阳性组患者的转移性疾病（M1 期）发生率显著更高（44.44% vs 9.9%，P = 0.001），且肿瘤复发或疾病进展率显著高于 EBERs 阴性组（55.56% vs 25.93%，P = 0.014）。
Survival analysis
本研究纳入 99 例患者。对原发性 NPC 病例的 Kaplan-Meier 生存分析显示，与 EBERs 阴性病例相比，EBERs 阳性内皮细胞患者的总生存期（OS，P = 0.020）和无远处转移生存期（DMFS，P = 0.004）显著更差。这些发现表明，内皮细胞 EBERs 阳性可能作为潜在的不良预后生物标志物，需要通过更大规模的研究进一步验证。
Analysis of humoral and cellular immunity indices in endothelial EBERs-positive NPC patients
对 99 例 NPC 患者的综合血清学评估显示，EBERs 阳性组和 EBERs 阴性组之间存在明显的免疫学模式，EBERs 阳性组与 EBERs 阴性患者相比，IgG、IgM 和补体 C4 有降低的非显著趋势，同时 IgA 和 C3 水平升高。对 peripheral 血单个核细胞的流式细胞术分析显示，EBV 阳性患者的循环 B 淋巴细胞百分比显著降低（P < 0.01），这表明内皮细胞的 EBV 感染可能通过对淋巴群体的直接病毒作用或对体液免疫的间接调节促进系统性 B 细胞耗竭，可能导致在 EBV 驱动的 NPC 进展中观察到的肿瘤免疫监视受损。
In vitro study on the EBV infection pathway in endothelial cells
对三种不同 EBV 感染策略下 HLECs 的 RT-qPCR 分析表明，未处理的野生型 HLECs 未检测到 EBV 相关基因或 CD21 的表达。值得注意的是，通过直接淋巴瘤细胞（Akata/Raji 细胞）接触感染的 HLECs 与其他感染模式相比，LMP1、LMP2A 和 EBNA1 的表达显著升高（P < 0.001）。补体依赖的细胞毒性试验证实游离淋巴瘤细胞已被有效消除，这可通过直接共培养的 HLECs 中 CD21 表达缺失来证明。这些结果证实，EBV 可能通过 B 淋巴细胞介导的细胞间传递有效感染 HLECs，诱导病毒癌基因（LMP1、LMP2A 和 EBNA1）的强烈表达，这可能关键影响受感染细胞的增殖和存活，潜在调节 NPC 肿瘤微环境。
Live-cell imaging and endocytosis protein analysis of HLEC interaction with Akata-GFP/Raji-GFP
活细胞成像显示，在共培养 12 小时内，HLECs 内化 Akata-GFP 细胞和 Raji-GFP 细胞，形成具有微弱荧光的特征性 “细胞 - in - 细胞” 结构。在 12 至 24 或 72 小时之间荧光信号的逐渐增强证实，通过直接 B 淋巴瘤细胞接触成功感染 HLECs。
RT-qPCR detection of endocytosis-related gene expression in HLECs
为从分子水平表征 HLECs 中的内吞过程，在三种不同感染模式下，在补体依赖的细胞毒性试验后收集 HLEC RNA，以检测内吞相关蛋白的表达水平。结果显示，与其他两种 EBV 感染策略相比，暴露于直接 Akata 细胞接触的 HLECs 中 Rab5a、Rab7a、EHD1 和 ARF6 的表达显著上调，差异具有统计学显著性（P < 0.001）。这表明 B 淋巴细胞介导的 EBV 传播特异性激活内皮细胞的内吞机制。
Single-cell transcriptomic profiling of EBV-positive nasopharyngeal carcinoma microenvironment
本部分 24 例样本的基线信息可在文献中找到。对 16 例 EBV 阳性 NPC 标本和 8 例正常鼻咽对照的综合单细胞 RNA 测序分析系统表征了肿瘤生态系统，通过谱系特异性标记识别主要细胞亚群：T 淋巴细胞（CD2/CD3/CD4/CD8）、髓系群体（CD14/CD68）、B 淋巴细胞（CD79/MS4A1）、浆细胞样树突状细胞（CXCR3/IL3RA）、成纤维细胞（COL1A1/COL1A2）、血管内皮细胞（VWF/PECAM1）和上皮细胞群（EPCAM/KRT19）。空间转录组与单细胞数据的整合实现了精确的细胞定位和 EBV 感染状态确定，揭示了明显的病毒嗜性，肿瘤上皮细胞的感染概率为 18.81%，成纤维细胞为 10.60%，巨噬细胞为 15.74%，内皮细胞为 8.11%， naive B 细胞为 5.71%，浆细胞为 6.01%，CD4?T 细胞为 4.62%，而 CD8?T 细胞和生发中心 B 细胞完全为 EBV 阴性，这突出了鼻咽肿瘤微环境中对 EBV 感染的选择性细胞许可性。
Transmission electron microscopy analysis of EBV infection
本研究使用 EBV 阳性 B 淋巴瘤 Raji 细胞研究直接接触介导的感染机制，透射电子显微镜显示与 HLECs 共培养 48 小时后形成明显的细胞 - in - 细胞结构。电子显微镜照片显示 HLECs 内存在 Raji 细胞碎片，提供了超微结构证据，证明 EBV 可能通过 B 淋巴细胞介导的直接细胞相互作用感染 HLECs。这些发现最终验证了内皮细胞中 EBV 感染的细胞间传递途径。
DISCUSSION
NPC 是一种区域性流行的恶性肿瘤，在东亚和东南亚发病率较高，潜伏性 EBV 感染已被证明在 NPC 发展中起关键作用。EBV 是人类中最常见的潜伏感染病毒，全球约 95% 的人口在其一生中都携带潜伏感染，但目前尚无有效的疫苗预防这种感染。先前的研究已确定 B 淋巴细胞和上皮细胞对 EBV 易感，且感染过程和关键受体已得到充分表征。尽管内皮细胞在肿瘤微环境中很重要，但 EBV 感染的内皮细胞在促进原发性肿瘤免疫逃逸和远处转移中的作用尚未得到充分探索，这主要是由于这些事件的频率相对较低，以及病理原位杂交染色切片中血管结构细微。
本研究通过将连续切片的 H&E 染色与原位杂交相结合，研究了瘤周组织中内皮细胞的
