基质刚度通过Hedgehog信号通路调控骨髓间充质干细胞成骨分化的机制研究

为解决骨缺损修复中干细胞命运调控难题，研究人员通过构建不同刚度PDMS基质，揭示基质刚度通过激活Hedgehog(Hh)通路促进BMMSCs成骨分化（ALP活性提升2.1倍，钙结节形成增加3.4倍），为骨组织工程支架力学特性设计提供理论依据。

　　

骨骼作为人体重要的支撑结构，其损伤修复一直是临床面临的重大挑战。尽管自体骨移植仍是金标准，但供体来源有限、二次创伤等问题促使科学家们将目光投向骨组织工程(Bone Tissue Engineering, BTE)。在这一领域，骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMMSCs)因其多向分化潜能成为明星细胞，而支架材料的力学特性——尤其是基质刚度(Substrate Stiffness)——被证实是决定干细胞命运的关键因素。然而，现有研究对"理想刚度"的结论存在矛盾：GelMA基质25kPa最优，藻酸盐(SA)水凝胶225kPa最佳，而PDMS基质14kPa效果最好。这种差异背后，是否隐藏着未被揭示的力学信号转导机制？

为解开这一谜题，研究人员通过精确调控聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane, PDMS)的交联比例，构建了刚度梯度体系（32.73±3.74kPa软基质、57.59±5.65kPa中等基质、147.4±11.04kPa刚性基质），并采用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)肽修饰表面以模拟天然骨基质。通过系统研究BMMSCs在不同刚度基质上的行为特征，发现刚性基质显著促进细胞铺展（面积增加2.3倍）和增殖（速率提升1.8倍）。更关键的是，成骨诱导实验显示刚性基质使碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)活性提高210%，钙结节(Calcium Nodule)形成量增加340%。分子机制研究表明，Hedgehog(Hh)通路关键蛋白在刚性基质培养第3天即被激活，而特异性抑制剂GANT61可完全阻断刚度依赖的成骨促进作用。

该研究发表于《The International Journal of Biochemistry》，主要采用四大关键技术：1）可调刚度PDMS基质的制备与RGD功能化；2）小鼠BMMSCs分离培养及流式细胞术鉴定（CD29⁺70.0%，Sca-1⁺97.4%）；3）力学信号转导通路检测（Hh通路关键蛋白免疫荧光定位）；4）特异性通路抑制模型构建（GANT61处理组）。

【研究结果】

1. BMMSCs的表型鉴定：流式分析显示分离细胞高表达CD29(70.0%)、CD40(97.2%)和Sca-1(97.4%)，符合国际干细胞治疗学会(ISCT)定义的MSCs标准。

2. 基质刚度影响细胞形态：刚性基质上细胞呈现典型铺展形态，伪足数量较软基质组增加3.2倍，细胞骨架应力纤维更密集。

3. 成骨分化评估：21天诱导后，刚性基质组ALP活性达软基质的2.1倍（p<0.01），茜素红染色显示钙结节面积占比达15.7±2.3%，显著高于其他组。

4. 机制解析：免疫印迹显示刚性基质组Smo蛋白表达量提升3.8倍，Gli1核转位增加4.2倍；使用GANT61抑制后，ALP活性下降至基础水平。

【结论与展望】
本研究首次阐明基质刚度通过Hh信号通路调控BMMSCs成骨分化的级联机制：力学刺激→整合素激活→Smo/Gli1信号转导→Runx2上调→成骨分化。这一发现不仅解释了不同研究中"理想刚度"差异的分子基础（材料特异性激活通路阈值不同），更为骨组织工程支架设计提供了双轨策略——通过协同优化力学特性和生化信号（如RGD密度）实现干细胞命运精准调控。未来研究可进一步探索YAP/TAZ等力学敏感因子与Hh通路的crosstalk，为开发"智能响应型"骨修复材料奠定基础。