肠道致病菌毒力调控因子Rns的配体结合口袋特征解析及其抑制机制研究

这篇研究深入解析了肠毒素性大肠杆菌(ETEC)毒力调控因子Rns（AraC/XylS家族成员）的配体结合口袋特征，通过结构生物学和微生物学技术证实脂肪酸通过结合R75/H20位点抑制DNA结合活性。研究发现Rns-I14F/I17F突变体可抵抗脂肪酸抑制，为开发针对AraC家族毒力调控因子的新型抗感染策略提供了重要靶点。

　　

肠道致病菌毒力调控因子的结构解析与功能机制

ABSTRACT
革兰阴性肠道病原体引起的腹泻疾病是儿童发病和死亡的主要原因。研究聚焦于肠毒素性大肠杆菌(ETEC)的毒力调控因子Rns，该蛋白属于AraC/XylS转录因子家族。最新结构研究表明，Rns的N端和C端结构域之间存在癸酸(decanoic acid)结合位点。通过定点突变和结构分析，发现R75和H20的带正电荷侧链对脂肪酸结合至关重要，而I14/I17突变可阻断配体结合。这些发现揭示了脂肪酸通过结合特定口袋抑制AraC家族毒力调控因子的共同机制。

INTRODUCTION
腹泻疾病每年导致约50万儿童死亡，其中ETEC感染占显著比例。传统疫苗开发面临挑战，而针对毒力调控因子的治疗策略可能避免抗生素耐药性问题。Rns作为AraC/XylS家族成员，调控菌毛和相关毒力因子的表达，是理想的治疗靶点。与典型AraC调控因子不同，Rns等毒力调控因子可被脂肪酸直接抑制，这一新发现打破了该家族仅通过蛋白互作调控的传统认知。

RESULTS

Decanoic acid interferes with Rns DNA binding
实验证实癸酸并不影响Rns蛋白稳定性，但显著抑制其DNA结合能力。电泳迁移率变动分析(EMSA)显示，MBP-Rns融合蛋白与DNA的结合随癸酸浓度增加而减弱，IC₅₀为1.15 mM。这表明脂肪酸通过直接干扰DNA结合而非促进蛋白降解来抑制Rns功能。

Electrostatic interactions contribute to occupancy of the decanoic acid binding pocket
晶体结构显示，R75和H20的侧链与癸酸羧酸头部形成3.0 ?的静电相互作用。R75A和H20A/R75A突变体在β-半乳糖苷酶报告系统中对5 mM癸酸仅表现出16%和8%的抑制，而野生型抑制率达90%。结构分析证实突变体结合口袋中缺乏脂肪酸电子密度，说明这些残基对配体结合至关重要。

Occlusion of the fatty acid binding pocket
将疏水口袋中的I14/I17突变为苯丙氨酸(I14F/I17F)可阻断癸酸结合，使蛋白获得脂肪酸抗性。晶体结构显示F14/F17侧链占据了脂肪酸结合空间，且H20/R75构象发生显著变化。有趣的是，该突变导致α2螺旋无序化，提示配体结合影响蛋白整体构象。

Overall structural analysis
比较野生型和突变体结构发现，未结合配体的蛋白表现出更大的结构柔性。测量A73和L219间距离显示，突变体结合口袋开口增加约1 ?。B因子分析进一步证实I14F/I17F突变体的DNA结合螺旋区域具有更高灵活性。

Specificity/promiscuity of the fatty acid binding pocket
除癸酸(C10)外，己酸(C6)、辛酸(C8)、十二酸(C12)和油酸(C18:1)均可抑制Rns活性。H20A/R75A双突变对所有测试脂肪酸均不敏感，而I14F/I17F对多数脂肪酸具有抗性，仅对己酸保留部分敏感性，表明口袋对不同链长脂肪酸的容纳能力存在差异。

DISCUSSION
研究确立了AraC毒力调控因子(Rns、ToxT等)被脂肪酸抑制的共同范式。关键发现包括：1)R75是羧酸头部结合的主要位点；2)脂肪酸结合通过稳定蛋白构象抑制DNA结合；3)口袋体积影响配体特异性。这些发现为开发针对AraC家族的小分子抑制剂提供了结构基础，这类抑制剂有望成为对抗多重耐药肠道感染的新策略。未来研究将聚焦于配体结合动力学和调控机制细节，为理性药物设计提供更多依据。