Illumina Complete长读长测序技术(ICLR)实现人类肠道宏基因组中细菌基因组的连续组装

（编辑推荐）本研究首次评估了Illumina Complete长读长测序(ICLR)在肠道宏基因组中的应用价值。相比传统短读长测序(9.9±4.5 kb)，ICLR显著提升组装连续性(N50达119.5±24.8 kb)，其基因组完整度(94.0%±20.6%)优于纳米孔测序(85.9%±23.0%)，且基因长度保留更完整(954.6±71.5 bp vs 924.6±114.7 bp)。该技术为低样本量、高精度宏基因组研究提供了新选择。

　　

ABSTRACT
宏基因组学技术无需培养即可直接解析肠道细菌的基因组成与功能特征。然而传统短读长测序产生的基因组片段化严重，Illumina最新推出的Complete长读长测序(ICLR)通过核苷酸类似物标记技术，在低DNA输入量下即可生成高精度千碱基级读长。研究团队首次将ICLR应用于肠道宏基因组，发现其组装连续性(N50 119.5±24.8 kb)显著优于短读长测序(9.9±4.5 kb)，与纳米孔测序(91.0±43.8 kb)相当，且基因组完整度更高(94.0% vs 85.9%)，基因长度保留更完整(954.6 vs 924.6 bp)。

INTRODUCTION
完整微生物基因组的获取是解析菌群互作机制的基础。尽管已有大量微生物基因组数据库，但短读长测序因重复序列和菌株异质性导致组装碎片化。虽然纳米孔和PacBio等长读长技术已实现肠道细菌基因组的环化组装，但其高样本量需求和高错误率限制大规模应用。ICLR技术通过PCR阶段随机标记长片段，经生物信息学重建获得连续读长，其6-7 kb的读长N50足以跨越细菌基因组中的插入序列和核糖体RNA基因等重复元件。

RESULTS AND DISCUSSION
在微生物模拟群落实验中，ICLR在5 Gbp测序深度即可达到预期41.1 Mbp组装长度，虽略低于纳米孔测序的组装连续性，但显著优于短读长方法。值得注意的是，ICLR对含大量插入序列的大肠杆菌和沙门氏菌的组装效果优于短读长，但对酿酒酵母基因组(含6 kb Ty重复元件)的组装仍存在局限。

在10例人类粪便样本的实际应用中，ICLR展现出三大优势：1) 组装总长度与短读长相当但连续性显著提升；2) 与纳米孔相比，其基因组完整度更高，这主要源于纳米孔组装的移码错误导致核心基因漏检；3) 能获得单contig、兆碱基级别的草案基因组。技术层面，ICLR采用标记-扩增-片段化的创新流程，既保留了Illumina平台的高精度特性，又通过生物信息学重建获得长读长信息。

MATERIALS AND METHODS
研究采用ZymoBiomics HMW DNA标准品和10例健康成人粪便样本，平行进行短读长(2×150 bp)、ICLR和纳米孔(Q20+ SQK-LSK112)测序。ICLR文库制备采用早期开发方案，包括基于溶液的DNA标记、16循环PCR扩增和双端大小选择。数据分析采用metaFlye 2.4.2组装，MetaBAT2/CONCOCT/MaxBin2联合分箱，CheckM评估基因组质量。值得注意的是，当前市售ICLR试剂盒已优化为磁珠标记和单步标记PCR，提高了操作便捷性。

技术局限性
当前ICLR对复杂真菌基因组的组装仍受限于读长不足，且研究采用的高测序深度(平均312 Gbp标记读长)尚未确定最佳成本效益平衡点。但随着ICLR分析软件在Illumina Connected Analytics平台的开放应用，该技术有望成为宏基因组研究的新标准工具，特别是在要求低样本输入和高精度的临床研究中具有独特优势。