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本文通过 CHO-S 细胞表达牛病毒性腹泻病毒（BVDV）主要免疫原性 E2 蛋白，开发间接 ELISA（rE2-iELISA）。优化条件后，该方法对 BVDV-1 和 BVDV-2 特异性强，灵敏度达 1:1500，稳定性良好，与 IDEXX ELISA 一致性 94.8%，为 BVDV 监测和疫苗效力评价提供可靠血清学工具。
Background
牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus, BVDV）是黄病毒科（Flavivirus）瘟病毒属（Pestivirus）的单链 RNA 病毒。在透射电镜下，BVDV 颗粒呈圆形或椭圆形，直径约 50 nm。BVDV 有两种生物型：细胞病变型（CP）和非细胞病变型（NCP）。该病毒可在牛胚胎早期发育阶段感染，导致持续感染（persistently infected, PI）动物的产生。
BVDV 分为三个基因型：BVDV-1、BVDV-2 以及近年发现的 BVDV-3（主要流行于巴西和东南亚地区）。其基因组包含一个开放阅读框（ORF），编码 4 种结构蛋白（C、E1、E2、E3）和 8 种非结构蛋白（Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B），ORF 位于 5’-UTR 和 3’-UTR 区域之间。E2 蛋白作为病毒包膜的重要组成部分，是主要的免疫原性糖蛋白，介导病毒附着和免疫逃逸，其 βG 发夹结构域在病毒与受体结合中起关键作用，对 BVDV 的抗原性和免疫中和至关重要。
哺乳动物表达系统在新基因发现、蛋白质结构功能研究及药物和疫苗生产中至关重要。CHO 细胞表达系统是目前最具代表性的哺乳动物细胞表达系统之一，其内源蛋白分泌少，便于重组蛋白纯化。经过 20 多年的广泛研究，CHO 细胞已成为外源蛋白表达的安全宿主，更易获得美国食品药品监督管理局（FDA）等监管机构的批准用于治疗性蛋白生产。
BVDV 在中国广泛流行，感染率高且缺乏有效治疗方法。许多国家的 BVDV 防控策略围绕识别 PI 动物展开，尤其在出生后早期检测对成功防控至关重要。据中国国家兽药数据库数据，截至 2025 年 5 月，已有 3 种灭活疫苗获批注册，包括 BVDV NM01 株（1 型）单价疫苗、BVDV NMG 株与 IBRV LY 株二价疫苗、BVDV NM01 株与 IBRV LN01/08 株二价疫苗。疫苗接种是预防 BVDV 等多种病毒性疾病的主要策略之一。He 等（2023）对 2018-2021 年中国部分省市接种牛群的 BVDV 中和抗体滴度进行纵向监测，发现中和抗体水平逐年稳定上升，表明接种显著提升了牛群整体免疫状态。Liu（2023）研究发现中国河北地区 BVDV 检出率低，可能与近年养牛业对 BVDV 的高度重视及大型牛场采取的及时清除 PI 牛、接种疫苗等防控措施有关。目前 BVDV 诊断方法多样，如病毒分离、免疫组织化学、抗原捕获 ELISA、RT-PCR 等，各有优劣，适用于不同诊断场景。ELISA 因操作简便、灵敏度和特异性高，成为 BVDV 检测的常用选择。本研究利用 CHO-S 真核表达系统生产 BVDV 重组 E2（rE2）蛋白，以其为包被抗原建立间接 ELISA 方法，旨在提高 BVDV 抗体检测的准确性，为临床诊断和免疫效果评价等相关研究提供技术支持。
Materials and methods
Virus strain, plasmids, and antibodies
本实验室保存有 BVDV JL-1 株（GenBank 登录号：KF501393.1）。pcDNA3.1 载体购自北京 Takara 生物医学技术有限公司；His-Tag 兔多克隆抗体（Epizyme，上海）、山羊抗兔 IgG（H+L）、HRP 标记山羊抗牛 IgG（Sangon Biotech，上海）；BVDV E2 特异性单克隆抗体（VMRD，美国 Pullman）；IDEXX BVDV 抗体检测试剂盒（IDEXX Laboratories, Inc.，美国 Westbrook）。本实验室制备了用于建立 iELISA 检测方法的阳性和阴性标准血清，以及猪瘟病毒（CSFV）、BVDV-1、BVDV-2、牛副黏病毒 3 型（BPIV-3）、牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）等毒株并保存。
Construction of the recombinant pcDNA3.1?E2 plasmid vector
采用高保真逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）从 BVDV JL-1 株基因组 RNA 中扩增 E2 蛋白全长基因序列。通过无缝克隆策略将线性化的 pcDNA3.1 (+) 载体与扩增的基因片段连接，转化至化学感受态 DH5α 细胞。为提高目的蛋白的翻译效率和分泌表达，在起始密码子前插入 Kozak 序列（GCCACC）和人 CD5 信号肽序列；在 C 端引入精确设计的 6×His 标签（CATCATCATCATCATCAT），便于重组蛋白的免疫学检测和镍柱亲和纯化。提取构建的质粒，经 1% 琼脂糖凝胶电泳验证后送吉林库美公司（长春）测序。使用 SnapGene 软件（6.0.2 版）对目的基因和获得的序列进行多序列比对分析，将序列完全一致的质粒命名为 pcDNA3.1-E2，于 - 80°C 避光甘油保存备用。
Expression and purification of recombinant proteins
采用 ExpiCHO?表达系统（Thermo Fisher Scientific，美国）进行 rE2 的瞬时转染表达。转染后收集细胞上清，使用预平衡的 Ni-Sepharose HisTrap? excel 柱（5 mL），通过 ?KTA explorer 100 色谱系统（GE Healthcare，美国）在 20 mM PBS（pH 7.4）缓冲系统中对细胞上清进行分析。纯化蛋白样品与 2× 还原 SDS 样品缓冲液混合，95°C 金属浴加热 10 min 使蛋白充分变性，用于 rE2 纯化分析。通过 10% Tris-Glycine SDS-PAGE 分离蛋白，用 0.25% 考马斯亮蓝 R-250 染色 1 h。蛋白质印迹分析中，SDS-PAGE 凝胶中的蛋白经 15 V 恒压电转移至 PVDF 膜（Merck Millipore，美国），室温下用 5% 脱脂奶粉 - TBST 封闭液（EpiZyme，中国）封闭 60 min；PVDF 膜与 1:5000 稀释的 His-tag 兔多克隆抗体（EpiZyme，中国）4°C 孵育过夜，随后与 1:8000 稀释的 HRP 偶联山羊抗兔 IgG（EpiZyme，中国）室温孵育 1 h，使用超灵敏 ECL 试剂（Beyotime，中国）化学发光显色。糖基化分析中，取 10 μg rE2 蛋白，用 1× 糖蛋白变性缓冲液（含 0.5% SDS 和 40 mM DTT）100°C 处理 10 min 变性；加入终浓度 1% 的 NP-40 和 1×GlycoBuffer 2 后，加入 500 U PNGase F（New England BioLabs，美国），37°C 孵育 1 h，通过上述 Western Blot 过程验证反应产物。
Development and optimization of the rE2?based iELISA
通过棋盘滴定实验确定包被抗原和血清样品的最佳工作条件：纯化 rE2 蛋白连续稀释至 8、7、6、5、4 μg/mL 作为包被浓度；BVDV 阳性对照血清按 1:40-1:140 稀释；HRP 标记山羊抗牛 IgG 按 1:5000-1:9000 梯度稀释。同时系统评估 7 种封闭剂（5% HS、3% HS、5% BSA、3% BSA、5% 脱脂奶粉、5% 明胶、3% 明胶）和二抗孵育时间（40、60、90、120 分钟）对检测性能的影响。标准操作流程：用 100 μL rE2 抗原（溶于 0.05 M 碳酸盐缓冲液，pH 9.6）4°C 包被过夜，PBST（含 0.05% Tween-20）洗涤 5 次；200 μL 优化封闭液 37°C 封闭 2 h；加入 100 μL 稀释血清 37°C 孵育 3 h，洗涤后加入 100 μL 优化浓度二抗 37°C 反应 1 h；TMB 显色 15 分钟后，加入 50 μL 2 M TMAH 终止反应，立即用酶标仪测定 450 nm 处吸光度（参考波长 630 nm）。所有实验条件经 3 次独立重复实验验证，以阳性 / 阴性对照 OD450 比值（P/N ≥ 2.1）为标准确定最佳反应体系。
rE2 protein-based iELISA and ROC analysis
采用 rE2-based ELISA 检测 160 份血清样品（80 份阳性和 80 份阴性牛血清，均经病毒中和试验（VNT）确认）中的 BVDV 特异性抗体。ELISA 检测时用 TBST 稀释样品。通过受试者工作特征（ROC）分析确定 iELISA 的临界值，使用 GraphPad 软件评估结果，基于 ROC 分析获得的最大约登指数确定临界值，计算相对灵敏度和特异性。
Evaluation of specificity, sensitivity, and technical reproducibility
用建立的 ELISA 方法检测 IBRV、BRSV、BPIV-3、CSFV 阳性血清及 BVDV 阳性和阴性血清，评估特异性。对 BVDV 阳性血清进行 1:100 至 1:5000 系列稀释，确定仍可检测到阳性结果的最高稀释度以评估灵敏度，每个样品做双复孔，计算平均值。特异性和灵敏度评估采用与临界值分析相同的公式：（样品 OD 值 - 阴性对照 OD 值）/（阳性对照 OD 值 - 阴性对照 OD 值）。批内重复性通过同一微孔板上 5 个不同孔检测同一样品评估；批间重复性通过 5 个独立制备的 ELISA 板检测同一组血清样品评估，计算精密度分析的变异系数（CV%）。
Testing of clinical samples
2022-2024 年，本实验室随机收集 500 份血清样品，分别用 rE2-iELISA、血清中和试验（SN）和商品化 IDEXX-ELISA 试剂盒检测 BVDV 抗体。对不一致结果，以 BVDV 全裂解物为抗原通过 Western blot（WB）确认。采用 Cohen's kappa 系数（κ）和一致性百分比评估方法间的统计学一致性。
Results
Expression and purification of recombinant BVDV E2 protein
通过 SDS-PAGE（图 1A）分析 ExpiCHO 细胞表达的融合 His 标签的重组 BVDV E2 蛋白，并经抗 BVDV E2 蛋白单克隆抗体（图 1B）和抗 His 单克隆抗体（图 1C）Western blot 验证。结果显示，细胞上清中存在分子量约 43 kDa 的目的蛋白，阴性对照中无（图 1B、C）。利用 Ni-His 亲和层析从细胞上清中纯化目的蛋白，获得高纯度 BVDV rE2 蛋白（图 1A）。生物软件预测 BVDV E2 蛋白含 4 个 N - 连接糖基化修饰位点，NetNGlyc 1.0 预测在 142、211、255 和 323 位存在潜在糖基化位点（图 1D）。去糖基化处理后，蛋白分子量从 43 kDa 变为约 38 kDa，表明存在糖基化位点（图 1E）。
rE2 protein?based ELISA and ROC analysis
rE2 蛋白 - based ELISA 参数优化结果如下：包被抗原浓度 4 μg/mL，血清样品稀释度 1:100（图 2A），二抗稀释度 1:5000（图 2B）；封闭液为 5% BSA，孵育时间 2 h（图 2C），该缓冲液有效降低背景反应和假阳性；二抗最佳孵育时间为 1 h（图 2D）。
对 160 份 BVDV 血清样品（80 份阴性，80 份阳性）采用 rE2-iELISA 检测，通过 ROC 分析确定临界值为 0.125（图 3A、B），OD450 值≥0.125 为阳性，<0.125 为阴性。ROC 曲线分析显示曲线下面积（AUC）为 0.998（p < 0.001）。
Evaluation of specificity, sensitivity, and reproducibility of rE2-iELISA
特异性评估显示，建立的 rE2-ELISA 方法仅检测到 BVDV-1 和 BVDV-2 阳性血清，IBRV、BRSV、BPIV-3、CSFV 阳性血清均为阴性，表明其特异性高（图 4A）。敏感性评估中，BVDV 阳性血清稀释至 1:1500 时仍可检测到阳性结果（图 4B）。间接 ELISA 方法重复性测试显示，批内变异系数为 1.38%-3.39%，批间变异系数为 1.36%-4.85%，均低于 5%，证实建立的 rE2-IELISA 方法可靠稳定（表 2）。
Validation of the rE2?iELISA
rE2-iELISA、SN 试验和商品化 IDEXX-ELISA 的比较分析显示，三种方法检测 BVDV 抗体的诊断性能存在显著差异（表 3）。在 500 份血清样品中，自制 rE2-iELISA 与两种参考方法一致性高，但灵敏度略有差异。与 SN 试验（430 份阳性，70 份阴性）相比，rE2-iELISA 检测到 440 份阳性和 60 份阴性，灵敏度更高，一致性显著（Kappa 值 = 0.81）。对 SN 试验误判为阴性的 10 份不一致样品进行 WB 分析，确认均为真阳性。与 IDEXX-ELISA（446 份阳性，54 份阴性）相比，rE2-iELISA 检测性能略低，商品化试剂盒多检测的 6 份阳性经 WB 确认。rE2-iELISA 与 IDEXX-ELISA 一致性极好（Kappa 值 = 0.83）。
Discussion
BVDV 是畜牧业重要病原体，可导致繁殖障碍、免疫抑制和黏膜疾病，造成重大经济损失。该病毒可在犊牛中建立持续感染，导致病毒持续排毒和群内广泛传播。准确早期检测对疾病管理至关重要，有助于预防暴发和降低传播风险。因此，建立可靠的诊断方法对 BVDV 感染监测和防控应用至关重要。目前尚无特异性药物预防或治疗 BVDV，国内外主要依靠综合措施，包括疫苗接种、病原和抗体检测、清除牛群中持续感染个体及群体净化。
血清抗体间接 ELISA 检测对人员和设备要求低，可快速直接获得诊断结果，在临床样品检测和疫苗诱导免疫抗体监测中极具价值，适合广泛应用。作为生物医学研究和临床常用血清学技术，ELISA 通过特异性抗原 - 抗体相互作用识别目标生物中的抗原或抗体。
本研究建立的间接 ELISA 方法相比传统诊断方法具有多项优势。高灵敏度和特异性使其能检测血清中低浓度 BVDV 抗体；以重组 E2（rE2）蛋白为包被抗原，通过靶向关键免疫原性病毒蛋白增强检测特异性；该方法成本效益高、操作简便、适合高通量筛选，是大规模监测项目的理想选择。
目前已报道的 ELISA 方法多采用原核系统表达的重组蛋白作为包被抗原。原核表达系统缺乏翻译后修饰，常导致蛋白抗原性不足，不仅增加蛋白纯化难度，还可能降低 ELISA 检测的灵敏度和特异性。为克服这些挑战，本研究采用真核表达系统制备 BVDV 重组 E2（rE2）蛋白。与哺乳动物细胞类似，真核系统可进行复杂的翻译后修饰（如糖基化、磷酸化），这对维持 E2 等病毒蛋白的结构和功能完整性至关重要。在哺乳动物细胞系中，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞和人胚肾 293（HEK293）细胞最常用于重组蛋白生产。CHO 细胞因生产力高、遗传稳定、可在大规模无血清悬浮培养中生长而受青睐。本研究选择 CHO 细胞表达 rE2，确保蛋白保留天然构象和抗原性。E2 蛋白作为 BVDV 的主要免疫原，对病毒附着和免疫逃逸至关重要。通过 CHO 细胞生产 rE2，保证了蛋白适用于诊断目的。
该间接 ELISA 方法的建立为兽医临床和实验室商品化诊断试剂盒开发奠定了坚实基础。此外，rE2 的成功表达为进一步研究 E2 蛋白的免疫原性和保护潜力提供了基础，这可能是开发新型 BVDV 疫苗的关键。持续优化和验证该方法对确保其在不同地理区域和 BVDV 基因型中的适用性至关重要。
Conclusion
本研究在 CHO-S 细胞中表达 BVDV E2 蛋白，经 GE 镍柱亲和层析纯化，以 rE2 蛋白为诊断抗原建立了检测 BVDV 抗体的间接 ELISA 方法。与病毒中和试验（VNT）相比，rE2-iELISA 具有更高的灵敏度、特异性和一致性，且比 VNT 更灵敏、成本效益更高。rE2-iELISA 有望成为大规模 BVDV 感染筛查和防控项目的快速、高效、经济的工具。
