OsRGLG6通过泛素化降解OsOTUB1调控水稻穗粒数与产量的分子机制

《aBIOTECH》：The RING-domain E3 ubiquitin ligase OsRGLG6 regulates rice grain number and yield via ubiquitination-mediated degradation of OsOTUB1

本研究针对水稻穗粒数遗传调控机制不明确的问题，通过酵母双杂交筛选发现E3泛素连接酶OsRGLG6与去泛素化酶OsOTUB1互作。实验证实OsRGLG6介导OsOTUB1的K48连锁泛素化降解，CRISPR/Cas9敲除突变体穗粒数显著减少，转录组分析揭示该模块通过植物激素信号、氮代谢和胁迫响应通路协同调控产量形成。该研究为水稻高产育种提供了新靶点。

　　

水稻养活了全球过半人口，其产量提升始终是农业科学的核心课题。穗粒数作为产量三要素中最易波动的性状，犹如一把双刃剑——每穗多结一粒谷，亩产就能跃升新台阶。然而自然界中，穗粒数的形成犹如精密编排的芭蕾，受众多基因网络调控，任何一个环节失调都可能导致"丰产不丰收"的困境。

以往研究聚焦于激素通路基因对穗型的调控，比如细胞分裂素激活酶LOG和降解酶CKX2就像调节穗分枝的"油门"和刹车"。但蛋白质翻译后修饰如何影响穗粒数，特别是泛素化-去泛素化这一对矛盾体的作用机制，仍是未解之谜。OsOTUB1作为卵巢肿瘤结构域去泛素化酶，虽被证实能通过稳定OsSPL14蛋白来增加穗粒数，但其自身稳定性如何被调控，恰似锁链缺失关键一环。

这项发表于《aBIOTECH》的研究，从寻找OsOTUB1的"幕后操控者"入手。研究人员采用酵母双杂交技术筛查水稻幼穗cDNA文库，犹如在蛋白互作网络中精准垂钓，最终捕获到E3泛素连接酶OsRGLG6。后续实验层层递进：GST pull-down和免疫共沉淀证实二者直接结合；体外泛素化实验显示OsRGLG6能给OsOTUB1"贴上"降解标签；细胞实验发现OsRGLG6像分子剪刀般促进OsOTUB1通过26S蛋白酶体途径降解。更引人注目的是，CRISPR/Cas9技术构建的osrglg6突变体虽植株高度不变，但穗粒数锐减，直观印证了该基因的关键作用。

关键技术方法包括：酵母双杂交筛选互作蛋白、CRISPR/Cas9基因编辑构建突变体、体外/体内泛素化分析、转录组测序、亚细胞定位观察、双分子荧光互补验证互作。实验材料采用水稻品种ZH11背景的转基因株系，干旱胁迫通过PEG6000模拟实现。

OsRGLG6与OsOTUB1互作验证

研究人员通过酵母双杂交筛选发现OsRGLG6能与OsOTUB1的C端结构域结合。GST pull-down实验显示纯化的GST-OsRGLG6蛋白可特异性捕获His-OsOTUB1。在烟草叶片和水稻原生质体中进行的双分子荧光互补实验，观察到OsRGLG6-nYFP与OsOTUB1-cYFP在细胞质中产生强烈荧光信号，免疫共沉淀进一步证实OsRGLG6-GFP与OsOTUB1-Flag在体内形成复合物。

OsRGLG6的亚细胞定位及对OsOTUB1稳定性的影响

系统发育分析显示OsRGLG6含有保守的vWA（von Willebrand A）结构域和RING（Really Interesting New Gene）结构域。亚细胞定位发现OsRGLG6-GFP主要定位于细胞质和内质网，与泛素化降解场所高度重合。共表达实验表明OsRGLG6不改变OsOTUB1的亚细胞分布，但显著降低其蛋白水平，提示其促进OsOTUB1降解。

OsRGLG6功能缺失突变体的表型分析

通过CRISPR/Cas9技术获得osrglg6-1（3bp缺失）和osrglg6-2（39bp缺失）两个突变体。田间表型观察发现突变体穗粒数显著减少，次级分枝数降低，但分蘖数增加。这种"穗少蘖多"的表型说明OsRGLG6特异性调控穗发育而非营养生长。

OsRGLG6介导OsOTUB1泛素化降解的分子证据

蛋白酶体抑制剂MG132处理能稳定OsOTUB1蛋白，证实其通过26S蛋白酶体途径降解。体外实验显示OsRGLG6在E1/E2酶存在时可发生自泛素化，并能催化OsOTUB1形成多聚泛素链。体内实验进一步验证OsRGLG6过表达增强OsOTUB1泛素化水平。双突变体osrglg6-2/osotub1的穗粒数恢复至osotub1水平，遗传学证明OsRGLG6通过降解OsOTUB1调控穗粒数。

OsRGLG6-OsOTUB1模块的下游调控网络

转录组分析发现806个差异表达基因，富集于植物激素信号转导、核糖体代谢等通路。RT-qPCR验证该模块共同调控分蘖基因MOC1、LAX1，氮转运基因OsNR2，赤霉素信号抑制子SLR1，以及干旱响应基因OsSIRP4、OsEREBP1等。这些基因表达改变揭示了OsRGLG6通过多通路协同调控生长发育与环境适应。

OsRGLG6-OsOTUB1模块参与干旱胁迫响应

PEG模拟干旱处理表明osrglg6-2和OsOTUB1-OE株系存活率显著降低。干旱诱导OsRGLG6转录上调，但不影响OsOTUB1转录水平。下游胁迫响应基因在突变体中表达受阻，ABA处理实验进一步证实该模块通过ABA信号通路介导干旱响应。

这项研究首次揭示了OsRGLG6-OsOTUB1分子模块通过泛素化降解途径调控水稻穗粒数的新机制。该模块像精准的分子开关：OsRGLG6作为E3连接酶给OsOTUB1贴上"降解标签"，解除其对OsSPL14等促穗粒因子的抑制作用，从而促进穗分枝形成。更值得关注的是，该模块同时调控干旱响应基因表达，打破了高产与抗逆性之间的传统矛盾。研究不仅完善了水稻穗粒数调控的理论框架，为分子设计育种提供了OsRGLG6这一重要靶点，更启示通过协调泛素化修饰网络可实现作物产量与抗逆性的协同提升。未来解析OsRGLG6在不同环境条件下的调控网络，将有助于培育适应气候变化的新种质。