Wadjet系统介导的质粒防御机制在梭菌属中的发现及其对遗传操作的突破性意义

《Applied Microbiology and Biotechnology》：SMC-like Wadjet system prevents plasmid transfer into Clostridium cellulovorans

本研究针对梭菌属细菌遗传操作效率低下的难题，首次在天然宿主中证实SMC样Wadjet系统通过切割环状DNA分子有效抑制接合质粒转移。通过构建jetABCD基因簇标记缺失株，发现突变株接合效率提升5个数量级，结合生物信息学分析揭示Bacillota门中Wadjet系统与<40 kb质粒的互斥分布规律，为微生物遗传工程提供了新型改造靶点。

　　

在微生物的世界里，细菌如同一个个微型堡垒，不断演化出精密的防御机制来抵御外来遗传物质的入侵。限制修饰系统（RM）和CRISPR-Cas系统作为经典的“免疫卫士”已被广泛认知，但近年来科学家们在细菌基因组中发现了超过50种新型防御系统，其中Wadjet系统（以埃及守护神Wadjet命名）因其独特的SMC（染色体结构维持）样蛋白结构而备受关注。这类系统能特异性识别并切割小分子环状DNA，理论上可有效阻断质粒的水平基因转移（HGT），然而其在天然宿主中的实际功能至今鲜有实证。

纤维素降解菌Clostridium cellulovorans作为生物技术领域潜力巨大的细胞工厂，其遗传操作却因多重防御系统存在而举步维艰。早期研究虽通过敲除RM系统提升了DNA导入效率，但接合转移频率仍徘徊在10^-7-10^-8的极低水平。这一瓶颈促使研究人员思考：是否还存在其他未知的“守门员”在阻碍遗传操作？

机遇出现在一次意外的实验观察中。当研究团队试图敲除engE基因时，意外获得一株自发突变株DengE/2，其接合效率竟飙升到10^-3级别。基因组测序揭示该突变株同时缺失了三个关键区域：Ⅱ型RM系统、推测性CRISPR-Cas基因座以及jetABCD基因簇（编码推定的Wadjet系统）。这一发现引出了核心科学问题：Wadjet系统是否才是限制质粒转移的真正“元凶”？

为解开谜团，研究团队运用CRISPR-Cas9n（Cas9切口酶）系统在野生株743B中实现了jetABCD的标记缺失。通过构建pNick系列载体，采用嗜纤维梭菌fdx启动子驱动茶碱响应型核糖开关，精确控制Cas9n表达。接合实验以E. coli CA434为辅助菌株，NEB10B携带pMTL83151质粒（4.5 kb）或联合placORMI甲基化质粒作为供体，通过斑点法接种于含HEPES缓冲液的厌氧培养基，经轨迹稀释技术定量计算转接合子频率。基因组编辑株经多次无抗生素传代培养实现质粒消除，最终通过Illumina和纳米孔测序验证基因型。

接合效率的飞跃性突破

实验数据显示：△jetABCD突变株对未甲基化质粒的接合效率达2.42×10^-3，较野生株提升约10⁵倍；而使用体内甲基化质粒时效率进一步提升至1.71×10^-2（图5）。这一增幅远超单独敲除Ⅱ型RM系统带来的百倍改善，证明Wadjet系统是C. cellulovorans中最主要的质粒转移屏障。

CRISPR-Cas系统的自发失活

研究还发现野生株中推定的Ⅰ-B型CRISPR-Cas系统（含35个间隔序列的CRISPR阵列及cas3/cas5/devR/cas8基因）在连续传代6次后自发缺失（图2）。序列分析表明“ACTTA”重复 motif 介导了Clocel_2327与Clocel_2352的基因融合，但间隔序列靶标鉴定未发现明确质粒或噬菌体同源区，其生物学功能仍待解析。

Wadjet系统的进化保守性

通过比对C. cellulovorans、C. beijerincki DJ123和C. kluyveri JZZ的JetD蛋白序列，证实其拓扑异构酶Prim结构域中催化活性位点完全保守（图3）。AlphaFold结构预测显示C. cellulovorans JetD具有典型TOPRIM折叠，与Bacillus cereus Q1的JetD结构高度相似，从进化角度支持其功能性。

生物信息学揭示的生态意义

对Bacillota门1,442个基因组的分析发现，携带完整jetABCD基因簇的菌株中仅2.2%存在质粒（图6）。值得注意的是，这些质粒大小均>40 kb，符合Wadjet系统对<50-100 kb环状DNA的尺寸识别阈值。唯一例外是来自宏基因组样本的Selenomonas sp.和Anaerostipes sp.报道携带<16 kb质粒，但因非纯培养来源而存疑。这种近乎绝对的互斥分布印证了Wadjet系统在自然界中高效阻断小质粒定植的进化优势。

该研究首次在天然宿主中实证Wadjet系统对接合质粒转移的强效抑制作用，其防御效率远超传统认知的RM系统。不同于序列特异性的RM系统，Wadjet通过JetABC复合体进行ATP依赖的环状DNA尺寸识别（SMC环挤压机制），并由JetD核酸酶执行切割，这种“分子卡尺”机制使质粒难以通过序列突变逃逸。从应用角度看，针对Wadjet系统的基因编辑为突破难培养微生物的遗传操作壁垒提供了新范式。研究提示在微生物“驯化”过程中，除常规RM系统外，应重视对Wadjet等新型防御系统的生物信息学筛查与靶向剔除，这将极大加速合成生物学元器件的底盘适配进程。

论文发表于《Applied Microbiology and Biotechnology》2025年第109卷，不仅深化了对细菌抗质粒防御机制的理解，更为开发高效微生物细胞工厂提供了关键技术支撑。随着更多隐蔽防御系统功能的揭示，人类驾驭微生物的能力必将迈上新台阶。