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本文揭示 piENOX2 在类风湿关节炎（RA）中高表达，通过靶向降解 Alkbh5 mRNA，影响 Itga4 的 m?A 修饰及 PI3K-AKT 通路，调控巨噬细胞极化。其抑制剂可缓解 RA，为 RA 治疗提供新靶点与思路。
类风湿关节炎与 piRNA 的研究背景
类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，以滑膜炎为特征，主要影响四肢小关节，可导致关节畸形和功能障碍。活化的滑膜巨噬细胞会促进炎症和组织损伤，目前的治疗药物面临并发症和复发等挑战，亟需新的治疗靶点和对发病机制的深入理解。
PIWI 相互作用 RNA（piRNA）是 2006 年发现的一类小非编码 RNA，通过 piRNA/PIWI 复合体调控转座元件、表观遗传修饰和蛋白质调控。其功能失调与生殖疾病、癌症、神经发育障碍等多种疾病相关，但在 RA 发病机制中的作用尚未明确。本研究聚焦于巨噬细胞来源的 piENOX2 在 RA 中的作用及机制。
材料与方法
DAS-28 评估：采用疾病活动度评分（DAS-28）评估 RA 患者的疾病活动度，该评分结合了 28 个关节的压痛数（TJC28）、肿胀数（SJC28）、血沉（ESR）和患者整体健康状况（GH），计算公式为 DAS-28=0.56×√TJC28 + 0.28×√SJC28 + 0.70×ln (ESR) + 0.014×GH。
胶原诱导关节炎（CIA）模型：对 6-8 周龄雄性 DBA1/J 小鼠诱导 CIA，将完全弗氏佐剂与牛 Ⅱ 型胶原乳剂皮内注射，21 天后用不完全弗氏佐剂与胶原乳剂加强免疫，对照组注射生理盐水。
piRNA 测序：加强免疫 2 周后处死小鼠，收集膝关节滑膜组织，经 RNA 提取、反转录、PCR 扩增和文库构建后，用 Illumina HiSeq 2500 平台测序，对测序数据进行过滤、比对、注释及差异表达分析，并对预测的 piRNA 靶基因进行 GO 和 KEGG 富集分析。
荧光原位杂交（FISH）：使用 Cy3 标记的 piENOX2 荧光探针，对 RA 患者和对照组的滑膜组织切片进行杂交，DAPI 染色后在荧光显微镜下观察 piENOX2 的表达和分布。
piRNA 筛选：经伦理委员会批准，收集 RA 患者和骨关节炎患者的滑膜组织，通过 piRBase 比对小鼠和人类 piRNA 序列，筛选出显著差异表达的 piRNA，设计合成模拟物和抑制剂，在脂多糖（LPS）处理的细胞中评估其对 IL-1β、IL-6 和 TNF 等炎症因子的影响。
组织收集与流式细胞术：收集 CIA 小鼠滑膜组织，经胶原酶和 DNase 消化后过滤、离心，获得单细胞悬液，染色后通过流式细胞术分析细胞群体。
骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）培养：从小鼠后肢骨髓中提取细胞，用含巨噬细胞集落刺激因子的培养基培养，获得 BMDMs 用于后续实验。
Man/LNP@piENOX2 INH 的构建与表征：制备 citrate 缓冲液，将 piENOX2 抑制剂（piENOX2 INH）与磷脂 - 乙醇溶液通过微流控装置混合，经超滤后加入 DSPE-PEG-Man，评估其粒径、包封率等特性。
体内小动物成像：对 CIA 小鼠尾静脉注射吲哚菁绿（ICG）标记的 Man/LNP@piENOX2 INH，通过小动物活体成像系统监测荧光分布，评估其靶向性。
体内治疗实验：对 CIA 小鼠每 3 天注射 Man/LNP@piENOX2 INH，共 6 次，监测爪厚度和关节炎评分，处死小鼠后收集血清、淋巴结和后肢样本进行分析。
甲基化 RNA 免疫沉淀测序（meRIP-seq）和定量 PCR（meRIP-qPCR）：通过 meRIP-seq 分析 m?A 修饰的 RNA 片段，结合 SRAMP 数据库预测 Itga4 的 m?A 位点，设计引物进行 meRIP-qPCR 验证。
统计学分析：实验至少重复 3 次，数据以均值 ± 标准差表示，用 GraphPad Prism 8.0 分析，两组比较用 t 检验，多组比较用单因素方差分析及多重比较检验，P<0.05 为差异有统计学意义。
研究结果
- 巨噬细胞来源的 piENOX2 在 RA 发病和进展中起重要作用
在 CIA 小鼠模型中，通过 piRNA 测序发现 RA 患者和 CIA 小鼠滑膜组织中 piENOX2 表达升高。RT-qPCR 验证了 piENOX2 在 RA 患者滑膜组织中的高表达，且其表达水平与 DAS-28 评分呈显著正相关。
流式细胞术和 FISH 分析显示，巨噬细胞是滑膜组织中 piENOX2 的主要来源，piENOX2 模拟物（piENOX2 MIM）促进巨噬细胞 M1 极化（增加 F4/80?CD86?细胞及 iNOS、IL-1β 等 M1 标志物），而抑制剂（piENOX2 INH）促进 M2 极化（增加 F4/80?CD206?细胞及 ARG1、TGF-β 等 M2 标志物）。
- 巨噬细胞靶向的 piENOX2 INH 脂质体前药（Man/LNP@piENOX2 INH）有效缓解 CIA 小鼠疾病进展
构建的 Man/LNP@piENOX2 INH 具有良好的靶向性，在 CIA 小鼠关节和爪部富集。体内治疗实验显示，该制剂显著减轻爪肿胀，降低关节炎评分，抑制滑膜组织增生和浸润，保护软骨结构完整性，减少骨丢失。
同时，Man/LNP@piENOX2 INH 可调节免疫稳态，恢复 CD4?/CD8? T 细胞比例，增加调节性 T 细胞（Treg）、减少 Th17 细胞，降低血清和滑膜组织中促炎因子水平，提高 IL-10 水平。
- piENOX2 通过靶向 Alkbh5 mRNA 调控巨噬细胞极化
生物信息学分析发现 piENOX2 可与 Alkbh5 mRNA 互补结合，分子对接验证了 piENOX2 与 PIWI 蛋白及 Alkbh5 mRNA 的结合。实验显示，piENOX2 MIM 降低 Alkbh5 的 mRNA 和蛋白水平，piENOX2 INH 则升高其水平。
Alkbh5 敲低可抑制 piENOX2 INH 对 M2 极化的促进作用，而 Alkbh5 过表达可阻断 piENOX2 MIM 对 M1 极化的促进作用，表明 piENOX2 通过靶向降解 Alkbh5 mRNA 调控巨噬细胞极化。
在髓系细胞特异性敲除 Alkbh5 的 CIA 模型小鼠中，Man/LNP@piENOX2 INH 的治疗效果降低
构建 Alkbh5 条件性敲除（Alkbh5 cKO）小鼠的 CIA 模型，发现与 Alkbh5flox/flox小鼠相比，Alkbh5 cKO 小鼠中 Man/LNP@piENOX2 INH 缓解爪肿胀、降低关节炎评分、保护关节结构及调节免疫和炎症的作用显著减弱，证实 ALKBH5 在 Man/LNP@piENOX2 INH 的治疗机制中不可或缺。
piENOX2 调控 ALKBH5 介导的 Itga4 mRNA m?A 修饰，通过 PI3K-AKT 信号通路影响巨噬细胞极化
meRIP-seq 和 meRIP-qPCR 显示，piENOX2 MIM 增加 Itga4 mRNA 的 m?A 修饰水平，piENOX2 INH 则降低其水平，且 ALKBH5 表达影响 Itga4 的 m?A 状态。piENOX2 MIM 下调 ITGA4 的 mRNA 和蛋白水平，piENOX2 INH 则上调。
机制上，piENOX2 INH 通过激活 PI3K-AKT 通路促进 M2 极化，敲低 Itga4 或使用 PI3K-AKT 抑制剂可阻断该效应；在 M1 极化模型中，piENOX2 INH 对 M1 极化的抑制作用也因 Itga4 敲低或通路阻断而减弱，表明 piENOX2 通过调控 Itga4 的 m?A 修饰及 PI3K-AKT 通路影响巨噬细胞极化。
讨论
本研究首次发现 piENOX2 在 RA 中的作用，其在 RA 患者和 CIA 小鼠滑膜组织中高表达，通过促进巨噬细胞 M1 极化加剧炎症。构建的巨噬细胞靶向递送系统 Man/LNP@piENOX2 INH 可有效缓解 CIA 小鼠的 RA 症状，为 RA 治疗提供了新策略。
机制上，piENOX2 与 PIWI 蛋白形成复合体，靶向降解 Alkbh5 mRNA，降低 ALKBH5 表达，导致 Itga4 mRNA 的 m?A 修饰增加、稳定性降低，ITGA4 表达减少，进而抑制 PI3K-AKT 通路，促进巨噬细胞 M1 极化，加速 RA 进展。这一发现揭示了 piRNA 在 RA 中的表观遗传调控机制，为开发 RA 精准治疗药物提供了重要靶点和理论依据。
生理状态下，ALKBH5 通过去甲基化稳定 Itga4 mRNA 表达，激活 PI3K-AKT 通路，促进巨噬细胞 M2 极化，维持免疫稳态；而在 RA 中，piENOX2 高表达破坏这一平衡，推动疾病发展。该研究不仅拓展了 piRNA 在自身免疫性疾病中的研究领域，也为理解 RA 的发病机制提供了新的表观遗传学视角。
