融合外显子-外显子连接区读段技术显著提升差异剪接检测效能

本研究针对RNA测序(RNA-seq)中传统差异外显子使用(DEU)分析忽略外显子连接区读段导致统计效能降低的问题，开发了差异外显子-连接区使用(DEJU)分析流程。通过整合STAR比对、Rsubread定量及edgeR/limma统计框架，在模拟数据和小鼠乳腺上皮细胞数据中证实DEJU能有效控制假发现率(FDR<0.05)，对可变剪接位点(ASS)和内含子保留(IR)事件的检测灵敏度提升30%，为癌症等疾病中异常剪接研究提供了更精准的工具。

　　

在真核生物中，单个基因通过选择性剪接(Alternative splicing, AS)可产生多个转录本，这种机制贡献了超过90%的人类基因多样性。然而，异常的剪接调控与癌症等疾病密切相关——例如乳腺癌中FGFR1基因的异常剪接会导致细胞分化紊乱。目前，基于RNA测序(RNA-seq)的差异外显子使用(Differential exon usage, DEU)分析是研究剪接变异的金标准，但传统方法存在明显局限：当读段跨越两个外显子时会被重复计数，且无法检测涉及剪接位点变异的细微剪接事件。

澳大利亚Walter and Eliza Hall医学研究所（The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research）的Mai T.Pham团队在《BMC Bioinformatics》发表研究，开发了差异外显子-连接区使用(Differential exon-junction usage, DEJU)分析流程。该工作通过创新性地整合外显子-外显子连接区读段信息，解决了传统方法的双重计数问题，使剪接变异检测灵敏度平均提升27%，特别是在识别可变剪接位点(Alternative 3'/5' splice site, ASS)和内含子保留(Intron retention, IR)事件方面表现突出。

关键技术包括：1）采用STAR双通道比对策略提高新型连接区识别率；2）通过Rsubread的featureCounts功能分别量化外显子和连接区读段；3）基于edgeR/limma框架开发diffSpliceDGE/diffSplice函数进行统计检验；4）使用小鼠乳腺上皮细胞(Luminal progenitor vs Mature luminal)数据集验证生物学意义。

结果
假发现率与统计效能
在模拟数据中，DEJU-edgeR对四种剪接模式（外显子跳跃ES、互斥外显子MXE、ASS、IR）的FDR控制在0.022-0.045之间，灵敏度达83.9-99.5%。相较之下，传统DEU方法对ASS和IR的检测失败率高达40%（图2）。当样本量增至10个/组时，DEJU对ASS事件的检测功率提升至97.7%。

计算资源
DEJU分析单样本仅需0.47分钟，内存消耗0.64GB，较DEXSeq提速38倍（表2）。这种高效性使其适用于TCGA等大规模癌症队列研究。

小鼠乳腺上皮细胞分析
在LP与ML细胞比较中，DEJU独特性识别出55%的差异剪接基因（图4A），包括调控EGFR信号通路的Mvb12a基因。典型案例如Fgfr1基因的连接区差异使用（调整P=0.018），该信号被传统DEU方法完全遗漏（调整P=1）（图4B）。

结论与讨论
该研究通过创新性整合连接区读段，解决了RNA-seq剪接分析中长期存在的双重计数和技术瓶颈问题。DEJU不仅提升了对已知剪接模式的检测灵敏度，更首次实现了对内含子保留事件的系统筛查。在应用层面，其高效的计算性能（10样本分析<1小时）使其成为大型癌症队列研究的理想工具。研究者特别指出，随着单细胞长读长测序技术的发展，未来有望将该方法拓展至单细胞分辨率，为肿瘤异质性和转移机制研究开辟新途径。