细菌半胱氨酸脱硫酶融合氧化还原敏感绿色荧光蛋白构建高灵敏度半胱氨酸生物传感器

研究人员开发了一种名为CyReB的基因编码生物传感器，通过融合细菌半胱氨酸脱硫酶(CD)与氧化还原敏感绿色荧光蛋白(roGFP2)，实现了对细胞内半胱氨酸动态变化的实时监测。该传感器利用CD-Rhd蛋白的催化特性，在存在半胱氨酸时促进roGFP2的氧化，表现出高特异性、灵敏度和可逆性。研究证实CyReB能有效检测大肠杆菌和酿酒酵母中的半胱氨酸水平变化，为研究半胱氨酸代谢及相关通路提供了新工具。

　　

半胱氨酸作为含硫氨基酸，在蛋白质合成、谷胱甘肽(GSH)生成以及硫化氢(H₂S)信号分子产生等关键生理过程中扮演核心角色。然而，由于其潜在的细胞毒性（特别是与游离铁相互作用时），细胞内半胱氨酸水平受到严格调控。半胱氨酸代谢紊乱与癌症、细菌毒力和抗生素耐药性等多种病理过程密切相关。目前，由于半胱氨酸易氧化为胱氨酸且分布于不同亚细胞区室，开发能够无损检测完整细胞中半胱氨酸动态变化的技术具有重要意义。

法国洛林大学（Université de Lorraine）的研究团队在《Redox Biology》发表研究，成功开发了一种名为CyReB（Cysteine Redox Biosensor）的新型基因编码生物传感器。该传感器通过将Pseudorhodoferax sp.来源的半胱氨酸脱硫酶-硫氰酸酶(CD-Rhd)融合到氧化还原敏感绿色荧光蛋白2(roGFP2)的N端，利用CD-Rhd催化半胱氨酸依赖的roGFP2氧化反应，实现了对细胞内半胱氨酸水平的高灵敏度、特异性监测。

研究主要采用以下关键技术方法：1）构建CD-Rhd与roGFP2的融合蛋白及其突变体（C334S和C466S）；2）体外测定传感器对不同浓度半胱氨酸、硫代硫酸盐和胱氨酸的响应；3）在大肠杆菌BL21(DE3)野生型和突变株（ΔgshA、ΔgrxA/B/C、ΔtrxA/C）中验证传感器功能；4）在酿酒酵母BY4742中测试传感器性能；5）使用荧光酶标仪进行比率测量（激发波长400/480 nm，发射520 nm），计算氧化程度(OxD)。

CyReB是氧化由半胱氨酸并通过谷胱甘肽-谷氧还蛋白系统还原的体外研究显示，CyReB在体外可被半胱氨酸特异性氧化，且该过程依赖于CD结构域中的Cys³³⁴和Rhd结构域中的Cys⁴⁴⁶。传感器对半胱氨酸的表观K_M值为35±6 μM，远低于单独CD-Rhd蛋白的273±26 μM，表明其具有更高的灵敏度。

CyReB在大肠杆菌和酿酒酵母中的功能验证表明，该传感器能特异性响应外源添加的半胱氨酸，而对硫代硫酸盐无反应。在大肠杆菌中，添加胱氨酸导致的CyReB氧化是通过胱氨酸还原为半胱氨酸实现的。研究还发现，谷胱甘肽(GSH)和谷氧还蛋白(GRX)系统对维持传感器的还原状态至关重要，而硫氧还蛋白(TRX)系统在此过程中作用有限。

研究人员利用CyReB探究了大肠杆菌中半胱氨酸-胱氨酸穿梭系统的还原机制。结果显示，在缺乏GSH合成酶(ΔgshA)或所有GRX(ΔgrxA/B/C)的突变株中，CyReB处于高度氧化状态，证实GSH/GRX系统是胞内胱氨酸还原的主要途径。相比之下，TRX系统缺失(ΔtrxA/C)对胱氨酸还原影响较小，表明细菌中TRX不参与该过程，这与哺乳动物中TRP14作为胱氨酸还原酶的作用机制不同。

这项研究开发的CyReB传感器为实时监测不同生理条件下细胞内半胱氨酸动态变化提供了有力工具。其创新性在于：1）首次实现基因编码的半胱氨酸特异性检测；2）可应用于原核和真核生物；3）揭示了GSH/GRX系统在大肠杆菌半胱氨酸-胱氨酸穿梭中的核心作用。该技术将促进对半胱氨酸代谢及其在疾病中作用机制的深入理解，为相关药物开发和治疗策略提供新思路。