基于3D体外人脑组织模型的细胞外囊泡miRNA动态变化揭示创伤性脑损伤的新型生物标志物及PI3K/AKT通路调控机制

针对创伤性脑损伤(TBI)诊断和预后评估的临床难题，Tufts University和Draper Laboratory的研究团队利用神经元-星形胶质细胞-小胶质细胞三培养3D人脑模型，通过Controlled Cortical Impact(CCI)模拟损伤，发现细胞外囊泡(EVs)携带的miR-124-3p、miR-137-3p等microRNA呈现急性期特异性表达模式，并证实其通过PI3K/AKT信号通路调控神经保护机制，为TBI早期诊断提供了新型生物标志物候选。

　　

创伤性脑损伤(TBI)是全球范围内导致死亡和残疾的重要健康问题，每年影响数百万人。尽管医学技术不断进步，但TBI的诊断和治疗仍面临重大挑战——现有临床预测模型如CRASH和IMPACT存在死亡率预测偏高、无法准确预测12-24个月不良预后等问题，而蛋白标志物如GFAP(胶质纤维酸性蛋白)在损伤后快速降解且缺乏预后价值。更令人担忧的是，近50%的轻度TBI患者在受伤6个月后仍无法恢复到伤前健康水平。这些临床困境的核心在于对TBI复杂病理生理过程的认识不足，特别是损伤早期分子事件与长期神经功能结局的关联机制。

在这一背景下，Tufts University（塔夫茨大学）和The Charles Stark Draper Laboratory, Inc.（查尔斯·斯塔克·德雷珀实验室）的研究团队将目光投向细胞外囊泡(EVs)这一新兴领域。EVs是直径30-200纳米的膜包裹颗粒，能够携带蛋白质、脂质和核酸等生物活性分子穿越血脑屏障，在神经细胞间通讯中扮演关键角色。临床研究已发现TBI患者EVs中GFAP和特定microRNA(miRNA)存在差异表达，但这些发现缺乏机制解释。传统研究受限于动物模型的种属差异、临床样本的异质性以及2D培养体系过于简化等问题，难以揭示EVs在TBI中的动态变化规律和作用机制。

为突破这些限制，研究人员创新性地采用包含人诱导神经干细胞(hiNSCs)分化的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的3D三培养脑组织模型，通过可控皮质冲击(CCI)装置模拟TBI，系统研究了损伤后EVs及其miRNA cargo的时序变化。这项发表在《Scientific Reports》的研究不仅验证了该模型可模拟TBI关键病理特征如神经元网络破坏和细胞活力下降，更重要的是发现了EVs中一组与PI3K/AKT(磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B)信号通路相关的miRNA在急性期的特征性表达模式，这些发现为理解TBI早期分子事件提供了新视角。

研究团队运用了多项关键技术：通过丝素蛋白-胶原复合支架构建具有中央窗口的环形3D培养体系；使用CCI装置以6 m/s速度、0.6 mm穿透深度实施标准化损伤；采用Exoquick-TC沉淀法分离EVs，并借助纳米颗粒追踪分析(NTA)和透射电镜(TEM)进行表征；运用qPCR和Nanostring nCounter平台分析798种miRNA表达谱；结合Ingenuity Pathway Analysis(IPA)进行通路预测；通过Luminex和Western blot验证PI3K/AKT通路蛋白变化。

Development and characterization of 3D human brain tissue model
研究首先建立了包含神经元(TUJ1⁺)、星形胶质细胞(GFAP⁺)和小胶质细胞(IBA1⁺)的三维培养系统。免疫荧光显示三种细胞在丝素蛋白支架中形成复杂网络，6周培养期间细胞活力保持稳定(p>0.05)。

TBI is induced by controlled cortical impact(CCI)
CCI损伤后，细胞活力显著下降(p<0.05)，LDH释放增加，TUJ1染色显示神经元网络广泛破坏，与既往研究中50%以上的网络密度损失一致。

EV isolation from the 3D brain tissue model following CCI
NTA显示EVs中位粒径为113-120 nm，Western blot证实存在CD63和TSG101标志蛋白而缺乏Calnexin，符合MISEV指南标准。损伤未显著改变EVs的浓度或粒径(p>0.05)。

EV MiRNA differential expression by qPCR characterization
靶向qPCR发现miR-124-3p、miR-137-3p和miR-204-5p在6h和48h显著上调(p<0.05)，而miR-320c在6h下调；miR-21-5p虽组间无差异，但损伤组内随时间表达增加(p<0.05)。

EV MiRNA profiling by Nanostring
高通量分析鉴定出18个差异miRNA(p<0.05，|log2FC|>1)，其中miR-423-5p在6h和48h持续上调，miR-181a-5p上调幅度最大，miR-30e-5p下调最显著。

PI3K/AKT pathway dysregulation predicted by pathway analysis
IPA分析显示12个miRNA与PI3K/AKT通路相关，涉及AKT、PTEN和TGFβ1等靶点。实验验证显示p-AKT在48h显著降低(p=0.0334)，但PTEN表达无变化。

这项研究通过创新的3D人脑组织模型，首次系统描绘了TBI后EVs及其miRNA cargo的时序变化图谱。研究发现的关键miRNA变化模式与临床研究高度一致——miR-124-3p、miR-137-3p的上调与TBI患者脑脊液变化相似，miR-320c的下调与儿童 concussion症状相关，而miR-423-5p的持续上调与严重TBI患者的临床轨迹吻合。这些发现不仅证实了该模型的生理相关性