木霉源几丁质酶的生物防治潜力：优化、纯化及对苹果土传病原菌的抗真菌活性

这篇综述系统研究了木霉（Trichoderma）源几丁质酶（Chitinase）的优化生产、纯化工艺及其对苹果土传病原菌（如Dematophora necatrix和Sclerotium rolfsii）的拮抗机制。通过筛选14株木霉菌株，确定最佳培养条件为pH 5、30°C、1%胶体几丁质（CCA）培养基，获得分子量40 kDa的纯化酶，其体外抑制率最高达92.22%（UHFTA005菌株），田间白纹羽病防效达86.67%，为苹果苗圃土传病害的生物防治提供了高效解决方案。

　　

1 引言

苹果（Malus × domestica）作为喜马拉雅地区重要的经济作物，长期连作导致土传病害加剧。木霉通过分泌几丁质酶（Chitinase）降解病原菌细胞壁主要成分几丁质（Chitin），成为生物防治的关键靶点。研究聚焦木霉菌株筛选、酶生产条件优化及田间应用效果，旨在替代化学农药解决苹果苗圃病害问题。

2 材料与方法

2.1 研究区域
从印度Himachal邦5个苹果主产区采集根际土壤，分离本土木霉菌株（如Trichoderma atroviride UHFTA005）和病原菌（D. necatrix）。

2.2 木霉分离与鉴定
采用ITS1/ITS4引物进行PCR扩增，经系统发育分析确认14株木霉分类地位，其中UHFTA005与T. atroviride CBS693.94株系亲缘性最高（100%支持率）。

2.3 酶生产优化
胶体几丁质（Colloidal chitin）制备采用HCl-乙醇沉淀法。通过单因素实验确定最佳产酶条件：7天培养期、pH 5、1%底物浓度、30°C，酶活性测定采用DNS法（Miller, 1959），以N-乙酰葡糖胺（NAG）为标准品。

2.4 纯化与表征
粗酶液经45%硫酸铵沉淀和Sephadex G-100层析纯化，SDS-PAGE显示纯化酶分子量为40 kDa。Bradford法测定蛋白浓度，UHFTA005比活性达43.32 U/mg。

3 结果与讨论

3.1 几丁质酶活性筛选
CCA培养基中，UHFTA005和UHFTV017产生显著透明水解圈（直径>10 mm），溴甲酚紫指示剂由黄变紫，证实高效几丁质分解能力。

3.2 酶稳定性分析
纯化酶在pH 4-6和30-50°C保持稳定，70°C时活性丧失80%，符合田间应用需求。

3.3 抗病原菌效果
体外实验中，0.60 μl UHFTA005几丁质酶对D. necatrix和S. rolfsii抑制率分别为92.22%和91.11%。盆栽试验显示，该处理使白纹羽病发病率降至13.33%（防效86.67%），幼苗株高增加89.73 cm，显著优于对照。

3.4 协同增效机制
木霉通过竞争营养、寄生作用及分泌β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase）等多重机制协同抑制病原菌，其中几丁质酶直接靶向病原菌细胞壁β-1,4糖苷键（β-1,4-glycosidic bond）。

4 结论

UHFTA005菌株产的40 kDa几丁质酶具备高效、稳定的生物防治潜力，其优化工艺和田间验证为苹果可持续种植提供了新策略。未来可进一步开发基于该酶的生物农药制剂。