Abstract
Background
一名 60 岁男性因坏死性胰腺炎并发反复菌血症，在 17 个月内被追踪观察，期间获得 6 株普罗威登斯菌（Providencia）临床分离株。初始分离株（R1）对 aztreonam-avibactam（ATM-AVI）敏感（MIC 4 mg/L），但 1 个月后采集的分离株（B1）出现耐药性（MIC >64 mg/L），且该耐药性在后续分离株中持续存在。
Objectives
探究 6 株普罗威登斯菌临床分离株的基因组和表型进化，重点研究 aztreonam-avibactam 耐药性出现的潜在机制。
Methods
采用全基因组测序（Whole-genome sequencing, WGS）确定菌株种类、系统发育关系及耐药决定因素。通过平均核苷酸一致性（Average nucleotide identity, ANI）和基因组内 DNA-DNA 杂交（in silico DNA-DNA hybridization, DDH）确认菌种分类。以 R1 为参考进行比较基因组分析，识别与耐药相关的突变。通过结构建模评估关键突变的功能影响。
Results
所有分离株均为序列型 ST44。系统发育基因组分析显示，这些分离株与杭州普罗威登斯菌（Providencia hangzhouensis）的亲缘关系比与雷氏普罗威登斯菌（P. rettgeri）更近，ANI（97%）和 DDH（76%）结果支持这一分类。所有分离株均携带 blaNDM-1 基因，与碳青霉烯类耐药性相关。耐药分离株在青霉素结合蛋白 3（Penicillin-binding protein 3, PBP3）的 420 位出现甘氨酸插入（p.Gly420dup），结构建模表明这一突变破坏了 aztreonam-avibactam 的结合。此外，还发现外膜蛋白 C（OmpC）存在 Gly151Asp 替代突变，可能影响药物通透性。其他外膜蛋白（OmpA、OmpD 或 OmpW）未观察到突变。
Conclusion
本研究发现 PBP3 的甘氨酸插入是驱动普罗威登斯菌对 aztreonam-avibactam 产生耐药性的新机制，结构建模及 OmpC 的额外突变支持这一结论。本研究为普罗威登斯菌中 aztreonam-avibactam 耐药性的新机制提供了证据，该机制由 PBP3 的甘氨酸插入驱动，并得到 OmpC 改变的支持。
Introduction
Aztreonam-avibactam（ATM-AVI）是一种新型 β- 内酰胺 /β- 内酰胺酶抑制剂（β-lactam/β-lactamase inhibitor, BLBLI）组合，旨在对抗多重耐药革兰氏阴性菌。 aztreonam 对金属 β- 内酰胺酶（metallo-β-lactamases, MBLs）介导的水解稳定，而 avibactam 可保护 aztreonam 免受丝氨酸 β- 内酰胺酶（如肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶，Klebsiella pneumoniae carbapenemase, KPC）的破坏。该组合有望成为治疗由产 MBL 的肠杆菌科细菌（Enterobacterales）等引起感染的选择，尤其适用于对其他 β- 内酰胺 /β- 内酰胺酶抑制剂组合耐药或碳青霉烯耐药肠杆菌科（Carbapenem-resistant Enterobacterales, CRE）感染的患者。
尽管 aztreonam-avibactam 尚未广泛应用，但在其未普及的情况下，临床医生已采用头孢他啶 - avibactam 联合 aztreonam 来应对产 MBL 的肠杆菌科细菌感染。临床实验室可通过成熟方法可靠测定 aztreonam-avibactam 的最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration, MIC），研究表明 MIC 测试条（MIC Test Strip, MTS）法与金标准肉汤微量稀释法（broth microdilution, BMD）的结果一致性高，基本一致性（essential agreement, EA）超过 90%。
PBP3 是一种转肽酶，参与细菌细胞壁肽聚糖的交联，是 β- 内酰胺类抗生素的主要靶点。PBP3 的突变或结构变化可降低 β- 内酰胺类药物的结合能力，从而导致耐药性。值得注意的是，PBP3 的插入修饰与 aztreonam-avibactam 组合的耐药性及治疗失败相关，例如在大肠杆菌（Escherichia coli）中发现 333 位存在四个氨基酸插入（YRIN/YRIK），但在其他肠杆菌科物种中此类研究尚少。本研究旨在探究反复碳青霉烯耐药菌血症患者的纵向普罗威登斯菌分离株的基因组特征，重点关注 aztreonam-avibactam 耐药性快速产生的潜在机制。
Case Presentation
一名 60 岁中国男性，有高血压和高血脂病史，于 2022 年 11 月因急性胰腺炎入院，后并发坏死性胰腺炎，需进行多次手术和重症监护。后续因并发症和手术，发展为反复呼吸机相关性肺炎和脓胸，需多次胸腔手术，并在住院期间多次发生菌血症。
2023 年 3 月，从气管内导管培养物中分离出一株产 NDM-1 的碳青霉烯耐药雷氏普罗威登斯菌（Providentia rettgeri）（分离株 R1）。2023 年 4 月，患者首次发生导管相关血流感染，从透析导管培养物中分离出产 NDM-1 的雷氏普罗威登斯菌（分离株 B1），随后反复出现呼吸道感染和菌血症，均分离出相同菌株（分离株 R2 和 B2）。
对于每次雷氏普罗威登斯菌感染，患者接受静脉注射头孢他啶 - avibactam 和 aztreonam 治疗，在通气需求和血流动力学稳定性方面有临床改善。急性恶化期间，在等待培养敏感性结果时，还短期使用了静脉注射阿米卡星。一年半后，患者于 2024 年 7 月因第三次产 NDM-1 的雷氏普罗威登斯菌菌血症去世（分离株 B3）。
Materials and Methods
Clinical isolates
在 17 个月内共获得 6 株纵向患者分离株（R1、R2、R3、B1、B2、B3），并进行回顾性分析。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS）在 Microflex 光谱仪（Bruker Daltonics, Bremen, Germany）上使用 Bruker MALDI Biotyper 数据库（3.0 版）将这些分离株鉴定为雷氏普罗威登斯菌。
Whole-genome sequencing (WGS), assembly, annotation and resistance gene prediction
从过夜平板培养物中使用 DNeasy Blood & Tissue Kits（Qiagen, Hilden, Germany）提取基因组 DNA。采用 Illumina NovaSeq 6000 测序（Illumina Inc., CA, USA）生成并组装 150 bp 配对末端 reads，基因组测序平均深度达 150×。使用 Trimmomatic v. 0.38 对原始 reads 进行修剪，然后用 SPAdes version 3.14.0 进行组装。使用 BUSCO 结合 bacteria_odb10 数据库评估基因组组装的完整性，通过 Prokka 进行基因组注释，利用 PlasmidSPAdes 识别质粒相关 contigs，通过 PlasmidFinder 2.1 识别质粒复制子类型。
为评估质粒的移动性，使用 oriTDB 预测转移起点（origin-of-transfer, oriT）位点、松弛酶、IV 型偶联蛋白（type IV coupling proteins, T4CPs）和 IV 型分泌系统组件（type IV secretion system components, T4SS）。通过 ABRicate 和 Resfinder 筛选获得性 antimicrobial resistance（AMR）决定因素，分离株中鉴定的 AMR 基因与数据库匹配序列的一致性为 100%。通过 PubMLST 普罗威登斯菌分型数据库确定序列型（sequence types, STs）。
以 R1 分离株的 Prokka 注释 GenBank（gbk）文件为参考，使用 Snippy（v4.6.0）调用后续 aztreonam-avibactam 耐药分离株的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）和插入 / 缺失（insertions/deletions, indels），采用 Snippy 默认参数，变异 calling 的最小深度覆盖阈值为 10 个 reads。
PBP3 and OmpC structural predictions
基于相应的蛋白质序列，使用 AlphaFold3 生成 PBP3 和 OmpC 的结构预测。使用 PyMOL（The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.2r3pre, Schr?dinger, LLC）评估和比对预测结构，通过 MAESTROweb 计算突变对蛋白质稳定性的影响。
Phylogenetic analysis
从 GenBank 检索普罗威登斯菌属物种的参考基因组，包括产碱普罗威登斯菌（Providencia alcalifaciens）、杭州普罗威登斯菌 Z24CR2199、杭州普罗威登斯菌 PR-310、西安普罗威登斯菌（Providencia xianensis）等多种普罗威登斯菌。以杭州普罗威登斯菌 PR-310（GenBank: GCA_029193595.2）为参考，使用 NASP pipeline v.1.0.0 检测核心基因组 SNP（core-genome SNPs）。通过 IQ-TREE 2 软件基于 concatenated SNP 比对推断系统发育关系，使用交互式生命树（interactive tree of life, iTOL）可视化树结构，通过 snp-dists 生成 NASP 的 SNP 矩阵输出。
通过普罗威登斯菌临床分离株与参考基因组之间的成对 ANI 和 in silico DDH（isDDH）评估基因组相关性，分别使用 Pyani 和 Genome-to-Genome Distance Calculator（GGDC）公式 2 进行分析，以 70.0% 的 isDDH 值或 96% 的 ANI 值作为定义细菌物种的阈值。
Aztreonam-avibactam and cefiderocol in vitro susceptibility testing
患者初始住院期间未进行 aztreonam-avibactam 药敏试验，对储存的分离株进行回顾性 MIC 测试。采用两种方法进行 aztreonam-avibactam 药敏试验：梯度扩散法（MIC 测试范围：0.016/4 至 256/4 mg/L，MIC Test Strip, MTS, Liofilchem, Italy）和肉汤微量稀释 EUAZAXF 平板（MIC 测试范围：0.03/4 至 64/4 mg/L，Sensititre? Thermo Fisher Scientific, MA, USA），两种方法中 avibactam 浓度均固定为 4 mg/L。
根据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, EUCAST）临床折点解释 MIC 结果，MIC 值≤4 mg/L 为敏感，>4 mg/L 为耐药。使用大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC 25922 和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）ATCC 700603 进行质量控制，大肠杆菌 ATCC 25922 的预期 MIC 范围为 0.03–0.125 mg/L，目标 MIC 为 0.06 mg/L；肺炎克雷伯菌 ATCC 700603 的预期 MIC 范围为 0.06–0.5 mg/L，目标 MIC 为 0.12–0.25 mg/L，所有质控结果均在预期范围内。
使用 UMIC? Cefiderocol 系统（Bruker Daltonics, Germany）测定对头孢地尔（cefiderocol）的表型敏感性，按照制造商说明，在缺铁条件下于阳离子调节 Mueller-Hinton 肉汤（cation-adjusted Mueller-Hinton broth, CAMHB）中制备 0.5 麦氏浓度的细菌悬液，测试的 MIC 范围为 0.03 至 32 mg/L，孵育后目视读取 MIC 值。根据 EUCAST 对肠杆菌科的临床折点解释结果：敏感≤2 mg/L；耐药 > 2 mg/L。
Results
Resistance development of aztreonam-avibactam in longitudinal Providencia clinical isolates
通过 MALDI-ToF 将 17 个月内获得的 6 株纵向患者分离株鉴定为雷氏普罗威登斯菌。2023 年 3 月采集的初始呼吸道分离株（R1）对碳青霉烯类耐药，但通过 MTS 和 Sensititre 法测定对 aztreonam-avibactam 敏感，其 aztreonam-avibactam MIC 为 4 mg/L，当时 aztreonam（无 avibactam）的 MIC 为 2 mg/L。然而，1 个月后的 2023 年 4 月获得的分离株（B1）对 aztreonam 单药及与 avibactam 联合用药均无抑制作用（MIC >64 mg/L），且所有后续分离株均呈现这一趋势。所有分离株均对碳青霉烯类耐药，美罗培南和亚胺培南的 MIC 均 > 32 mg/L。
Resistance Gene Profile and Phenotypic Correlation in Clinical Isolates
6 株临床分离株均属于同一序列型 ST44，且携带相同的获得性耐药基因谱，包括 blaNDM-1、blaPER-4、blaOXA-10、aph (4)-Ia、aph (3')-Ia、aac (3)-IV、aac (6')-Ib-cr、floR、arr-3、sul1、sul2、aadA1、ant (2'')-Ia 和 catB8。NDM-1 基因的存在与碳青霉烯类耐药表型相关。OXA-10 是一种 D 类 β- 内酰胺酶，具有较弱的碳青霉烯酶活性，在低外膜通透性背景下可导致碳青霉烯耐药性。
Plasmid Context and Genetic Environment of Resistance Genes
PlasmidSPAdes 分析显示，碳青霉烯酶基因 blaNDM-1、blaPER-4、blaOXA-10以及氨基糖苷类和其他 β- 内酰胺耐药决定因素分布在三个不同的质粒衍生 contigs 上，这些 contigs 富含插入序列（insertion sequence, IS）元件。携带 blaNDM-1 的 contig（71,501 bp）包含多个与移动相关的基因，包括 tra 和 trb 操纵子的组件，表明其可能具有接合性质粒骨架。第二个 contig（27,712 bp）同时携带 blaOXA-10 和 blaPER-4，第三个 contig（27,330 bp）编码氨基糖苷类修饰酶，这些 contigs 上未检测到已知的质粒复制子。
Whole-genome phylogenetic analysis and isolates identification as Providencia hangzhouensis
BUSCO 分析显示基因组的基因完整性为 100%，组装的普罗威登斯菌基因组平均大小约为 4.6 Mbp，总体 G+C 含量为 40.7 mol%，与包括杭州普罗威登斯菌 PR-310 和雷氏普罗威登斯菌 FDAARGOS1450 在内的其他普罗威登斯菌属成员的基因组大小和 G+C 含量相当。
核心基因组 SNP 系统发育分析表明，临床普罗威登斯菌分离株与杭州普罗威登斯菌的亲缘关系比与雷氏普罗威登斯菌更近。物种划分分析进一步支持这一观察结果，分离株与杭州普罗威登斯菌的 ANI 约为 97%，isDDH 相似性为 76%；而与雷氏普罗威登斯菌的 ANI 约为 92%，isDDH 为 47%，强调其与杭州普罗威登斯菌的遗传关系更近。
PBP3 insertion mutation and OmpC Gly151Asp mutation as potential causes of reduced in vitro susceptibility to aztreonam–avibactam
通过将连续 aztreonam-avibactam 耐药分离株的测序 reads 与初始分离株（R1）比对进行突变分析，以识别与耐药相关的突变。在 aztreonam-avibactam 耐药分离株的编码序列（coding sequences, CDS）中检测到的 SNP 和 indels 中，PBP3 和 OmpC 的两个氨基酸突变值得关注，因其可能在介导药物耐药性中发挥作用。
在 PBP3 中， aztreonam-avibactam 耐药分离株在核苷酸位置 1261 处出现三个核苷酸（+GGG）的框内插入，导致 420 位甘氨酸（Gly）残基增加（p.Gly420dup）。预测结构分析显示，这种插入可能导致活性位点附近的环略微延长，这一修饰可能损害 aztreonam-avibactam 的结合效率，从而导致耐药性。
OmpC 的 Gly151Asp 突变位于 β- 桶的内表面，在此处引入了一个体积更大、带负电荷的残基。这种替代理论上可能通过缩小通道直径和改变局部电荷分布来改变孔结构，从而影响溶质通透性，但预测的 ΔΔG 为 - 0.488 kcal/mol，表明蛋白质结构仅轻微不稳定。值得注意的是，在其他外膜蛋白如 OmpA、OmpD 或 OmpW 中未检测到突变。
PBP3 (p.Gly420dup) and OmpC Gly151Asp mutations do not appear to confer cefiderocol resistance
外膜蛋白突变和 PBP3 的靶标修饰是导致头孢地尔耐药的关键机制之一，例如 PBP3 的 333 位四个氨基酸插入（YRIN 或 YRIK）与肠杆菌科对头孢地尔的敏感性降低相关；此外，在肠杆菌属（Enterobacter spp.）中，ompC 和 ompF 的改变常与 AmpC β- 内酰胺酶和超广谱 β- 内酰胺酶（Extended-spectrum β-lactamases, ESBLs）联合作用导致耐药性。
鉴于存在 PBP3（p.Gly420dup）和 OmpC Gly151Asp 突变，进行头孢地尔药敏试验以评估它们对耐药性的潜在影响。所有分离株均对头孢地尔耐药，MIC 范围为 16 至 > 32 mg/L，表明 PBP3 Gly420dup 和 OmpC Gly151Asp 突变单独不会导致头孢地尔耐药。然而，由于缺乏杭州普罗威登斯菌已建立的头孢地尔 MIC 数据，限制了对该物种敏感性的准确解读。
Discussion
近期研究发现杭州普罗威登斯菌是一种新兴病原体，常与尿路感染相关，且常被误鉴定为雷氏普罗威登斯菌。全基因组测序显示杭州普罗威登斯菌分离株通常携带超广谱 β- 内酰胺酶（Extended-spectrum β-lactamases, ESBLs）和碳青霉烯耐药基因，可能导致临床治疗失败。在杭州普罗威登斯菌中，blaIMP-27是最常见的碳青霉烯耐药决定因素，占比 46.15%（78 株中的 36 株），其次是 blaNDM-1。本研究为产 NDM 的普罗威登斯菌物种与人类感染相关的证据增添了新内容。
本研究分析表明，关键抗菌耐药基因（包括 blaNDM-1、blaPER-4和 blaOXA-10）位于质粒相关 contigs 上。尽管未检测到已知的质粒复制子，但移动相关基因（tra、trb）和预测的 oriT 位点的存在表明这些 contigs 可能代表具有接合潜力的质粒。耐药决定因素常与插入序列和转座酶聚集，表明其处于可移动的遗传环境中。长读长测序有助于解析质粒结构并更好地评估其转移潜力，这种质粒介导的结构与先前在普罗威登斯菌属中的报道一致，其中耐药基因（特别是 NDM 变体）通常嵌入不同质粒骨架上的复杂移动遗传元件中。
PBP3 插入越来越被认为是导致 aztreonam-avibactam 敏感性降低的原因，例如 YRIN 插入单独或与获得性 AmpC 酶（尤其是 CMY-42）联合作用，可使 MIC 升高至 8–16 mg/L，而大肠杆菌的典型敏感范围为 0.03–0.25 mg/L。除了 P333 位后的 YRIN 或 YRIK 插入外，在一株大肠杆菌中发现了异常的 β- 内酰胺 MIC（8 μg/ml），该分离株因基因重复在 PBP3 的 Tyr344 后出现 TIPY 插入。
除 PBP3 突变外，其他新的耐药机制也已有描述，例如在桑肠杆菌（Enterobacter mori）菌株中，诱导突变后 SHV-12 β- 内酰胺酶的 Arg244Gly 替代与耐药性相关，该突变通过改变结合能和抑制常数破坏 avibactam 结合，使 aztreonam-avibactam 的 MIC 升高至 4 mg/L；类似地，在产双重碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌的体外选择实验中，CMY-16 的特定替代（Tyr150Ser 和 Asn346His）显著降低了 avibactam 的效力，导致耐药性。这些发现凸显了产 MBL 和 AmpC 的菌株中 aztreonam-avibactam 耐药性的潜在风险，强调了加强监测和深入研究的必要性。
非特异性外膜蛋白（如大肠杆菌的 OmpC 和 OmpF 及其在其他肠杆菌科物种中的同源物）在调节抗生素敏感性方面发挥重要作用。在 β- 内酰胺耐药性中，OmpC 和 OmpF 是主要的外膜蛋白，
