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本文发现 RNA 结合蛋白（RBP）Npl3 是自噬的新型调控因子。Npl3 缺失会严重阻碍 bulk 及选择性自噬，其缺陷在于自噬体 - 液泡融合受损，而非自噬体生成。该调控依赖其 RNA 结合域（RRM2）及核重入能力，为自噬的转录后调控增添新层面。
ABSTRACT
大自噬（自噬，Autophagy）是一种高度保守的分解代谢膜 trafficking 过程，通过该过程，从蛋白质到细胞器的各种细胞内成分被靶向运输至液泡 / 溶酶体进行降解。自噬在多个水平上受到时间和强度的严格调控，以防止活性过高或过低。迄今为止，仅有少数 RNA 结合蛋白（RNA-binding protein, RBP）被鉴定为调控自噬必需基因的表达，而转录后调控在自噬活性中的作用仍知之甚少。本研究通过对自噬缺陷突变体的遗传筛选，鉴定出核质穿梭的 mRNA 结合蛋白 Npl3 对 bulk 自噬和选择性自噬均至关重要。缺失NPL3不影响自噬体的生物发生、闭合或成熟，但严重损害自噬体 - 液泡融合，导致自噬体周转极少。研究进一步表明，这种调控依赖于 Npl3 的 RNA 结合域及其核重入能力。这些结果揭示了自噬转录后调控的一个新型层面。
INTRODUCTION
大自噬（以下简称自噬，Autophagy）是一种进化上保守的、依赖液泡 / 溶酶体的细胞内降解过程，普遍存在于所有真核细胞中。在酵母中，自噬诱导导致在一个或多个液泡周围位点（称为吞噬泡组装位点，PAS）形成初始的双层膜结构，即吞噬泡。吞噬泡包裹多种细胞内物质，包括胞质蛋白、脂质、蛋白聚集体以及受损或多余的细胞器。杯状的吞噬泡通过整合多种来源的脂质逐渐扩张，直至密封并成熟为完全包裹 cargo 的自噬体。随后，自噬体的外膜与液泡膜融合，将内膜及其包裹的 cargo 释放到液泡腔中。在液泡内，驻留的水解酶降解自噬 cargo，产生的大分子被运回胞质进行再利用。
自噬在基础非应激条件下以低速率持续进行，作为关键的质量控制机制；而在各种应激信号（尤其是饥饿）下可被高度诱导，作为适应和存活策略。自噬功能失调或调控异常与多种人类疾病相关，包括癌症、肌病、肝心肺疾病、代谢紊乱、自身免疫和神经退行性疾病。
分子遗传学研究已在酵母中鉴定出超过 40 个自噬相关（autophagy related, Atg）基因，其编码的蛋白质协同作用，高度协调地执行自噬的各个步骤。在ATG/Atg基因 / 蛋白的转录和翻译后调控方面已取得显著进展。然而，直到最近，由 RNA 结合蛋白（RBP）组合介导的转录后调控才被认为是自噬调控的关键层面。RBP 通过保守的 RNA 结合域与特定序列或结构的 RNA 动态相互作用，通过控制 mRNA 生命周期的各个方面（包括加工和化学修饰（5’加帽、剪接、多聚腺苷酸化和甲基化）、空间组织（核输出和胞质定位）以及翻译重编程（翻译起始、效率和 RNA 降解））来调控基因输出。RBP 是响应各种细胞应激（如热 / 冷休克、DNA 损伤、缺氧、氧化应激和代谢变化）时调节 RNA 命运和功能以改变蛋白质合成的关键因素。近期研究表明，一些 RBP 通过调控自噬体生物发生必需的部分ATG mRNA 的剪接、修饰、稳定性或翻译，在基础和刺激条件下精细调节自噬水平。但自噬转录后调控的生物学机制仍处于探索阶段，RBP 是否在自噬的其他步骤（如吞噬泡闭合和自噬体 - 液泡融合）中发挥作用尚不清楚。
吞噬泡闭合后，密封的双层膜自噬体需要成熟以获得融合能力，这包括 Atg machinery 的释放和融合 machinery 的招募。磷酸酶 Ymr1 对自噬体膜上磷脂酰肌醇 - 3 - 磷酸的去磷酸化和清除，对已完成自噬体上 Atg machinery 的解体至关重要；未能移除 Atg 蛋白会导致融合缺陷。自噬体靶向液泡进行融合需要多种膜动态调控因子的协同作用，包括可溶性 N - 乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor, SNARE）蛋白、RAB GTP 酶 Ypt7 及其鸟嘌呤核苷酸交换因子 Mon1-Ccz1，以及同型融合和蛋白分选（homotypic fusion and protein sorting, HOPS） tethering 复合体。这些步骤在基因表达水平上的调控机制仍不明确。
本研究旨在寻找新的自噬转录后调控因子，通过对 RNA 结合蛋白基因缺失突变体库的遗传筛选，鉴定出 Npl3 对非选择性和选择性自噬均至关重要。Npl3 缺失不影响自噬体的生物发生或成熟，但导致自噬体 - 液泡融合缺陷和自噬流减少。此外，Npl3 的 RNA 结合能力和核定位对其在自噬中的调控作用至关重要。这些发现表明 RBP 构成基因调控的重要层面，并调节自噬过程的多个步骤。
RESULTS
Npl3 是 bulk 自噬和选择性自噬所必需的
为鉴定响应饥饿调控自噬的 RBP，研究利用已建立的 GFP-Atg8 加工实验对 RBP 基因缺失突变体库进行遗传筛选。Atg8 是一种高度保守的泛素样蛋白，对自噬诱导和自噬体形成至关重要。自噬起始后，Atg8 发生脂化并定位于吞噬泡的内外膜。与成熟自噬体外膜相关的 Atg8 随后通过 Atg4 依赖的酰胺键切割（去共轭）释放，而被困在内膜上的 GFP-Atg8 则被运至液泡降解。由于 GFP 对液泡水解酶相对耐受，GFP-Atg8 向 GFP 的转化可用于监测自噬活性。野生型（WT）菌株在转移至无氮培养基后，游离 GFP 的量及其与总 GFP 的比值随时间增加。在 RBP 突变体中，npl3?菌株的自噬活性显著降低，表明 Npl3 是高效自噬所必需的。
为验证结果，研究在vac8缺失背景下检测前体氨肽酶 I（prApe1）的成熟情况。prApe1 在营养丰富条件下通过 Vac8 依赖的胞质 - 液泡靶向途径运至液泡，在饥饿条件下通过自噬途径运输；到达液泡后，prApe1 的前肽被蛋白水解切割为成熟活性形式 Ape1。在 WT（vac8?）菌株中，自噬诱导前几乎所有 Ape1 以前体形式存在，氮饥饿 1 小时后约 50% 的 prApe1 成熟；而在vac8? npl3?菌株中，prApe1 成熟显著减少，与 GFP-Atg8 加工实验结果一致。
研究进一步探究 Npl3 是否参与选择性自噬（如线粒体自噬和过氧化物酶体自噬）。通过在线粒体基质蛋白 Idh1 和过氧化物酶体 integral 膜蛋白 Pex14 的 C 端标记 GFP，当线粒体自噬或过氧化物酶体自噬诱导时，含 Idh1-GFP 或 Pex14-GFP 的多余线粒体或过氧化物酶体被靶向液泡降解，Idh1 或 Pex14 被蛋白水解降解，而 GFP 部分相对稳定并在液泡中积累，可通过免疫印迹进行半定量分析。通过在适当培养基（含乳酸或油酸）中培养菌株积累这些细胞器后，经氮饥饿处理，WT 细胞中游离 GFP 随时间显著积累；而在npl3?菌株中，游离 GFP 的量大幅减少，表明 Npl3 对线粒体自噬和过氧化物酶体自噬也是必需的。在 BY4742 遗传背景中重复自噬、线粒体自噬和过氧化物酶体自噬实验，结果一致，进一步支持 Npl3 在这些途径中的必需作用。
自噬缺陷会导致寿命缩短和营养缺乏条件下的存活力下降，酵母在长期氮饥饿后的存活情况可作为自噬整体过程的可靠衡量标准。为评估 Npl3 在自噬中的生理意义，研究检测了 Npl3 缺陷酵母菌株在长期氮剥夺期间的存活力。在饥饿过程中，WT 细胞死亡极少；而npl3?菌株在饥饿 5 天后存活力显著降低，在 SD-N 中 10 天后存活力几乎完全丧失。这些结果表明，Npl3 在氮饥饿期间对 bulk 自噬和选择性自噬都是必需的。
Npl3 缺失细胞在氮饥饿期间积累液泡周围的密封自噬体
自噬过程包括诱导、成核、吞噬泡扩张、闭合、自噬体 - 液泡融合以及分解和再利用等阶段，自噬活性降低可能由任何阶段的缺陷引起。为明确npl3?菌株自噬缺陷的性质，研究在氮饥饿条件下通过荧光显微镜分析 GFP-Atg8 puncta 的形成和定位，这些 puncta 代表 PAS 或形成中的 / 成熟的自噬体。氮饥饿 1 小时后，WT 和npl3?细胞中具有液泡周围 GFP-Atg8 puncta 的细胞百分比相似，但突变体细胞中的 puncta 荧光强度明显更高。随时间推移，WT 细胞的 GFP-Atg8 puncta 总数减少，但液泡腔荧光因游离 GFP 积累而显著增加，3 小时后几乎 100% 的细胞显示液泡荧光，且比胞质荧光亮得多，这与成熟自噬体与液泡融合后 GFP-Atg8 含自噬小体进入液泡腔一致。相反，npl3?细胞的胞质 GFP-Atg8 随时间积累，胞质荧光强度明显高于液泡信号，且即使饥饿 3 小时后仍能检测到持续的液泡周围 puncta。同样，在线粒体自噬或过氧化物酶体自噬诱导条件下，WT 和npl3?细胞中均形成含线粒体或过氧化物酶体的 Atg8 阳性结构；WT 细胞中这些结构逐渐被运至液泡，液泡 Atg8 信号增加，与正常自噬流一致；而npl3?细胞中这些结构在胞质中积累。这些观察表明，npl3?菌株中吞噬泡能够形成，但要么不能成熟为闭合的自噬体，要么自噬体不能与液泡融合。
为确定液泡附近的 Atg8 含 puncta 是未密封的吞噬泡还是未能与液泡融合的完全密封自噬体，研究进行了 prApe1 蛋白酶保护实验。在该实验中，裂解的酵母原生质体中未被膜包裹的游离 prApe1 的前肽易被外源蛋白酶切割为成熟 Ape1；相反，密封自噬体内的 prApe1 受蛋白水解切割保护，除非加入去污剂裂解自噬体膜。在atg9?细胞（吞噬泡扩张缺陷）中，prApe1 在无去污剂时也被蛋白酶 K 完全加工，因为所有 prApe1 游离在胞质中；而在vam7?细胞（自噬体 - 液泡融合缺陷）中，超过一半的 prApe1 对蛋白酶 K 有抗性，代表被密封自噬体包裹的部分，且在去污剂处理后完全切割。类似地，npl3?细胞中的大部分 prApe1 对蛋白酶 K 处理有抗性，但在膜溶解后可切割，表明这些细胞中积累的 Atg8 阳性结构对应密封的自噬体。npl3? vam7?双敲除细胞作为对照，在无去污剂时 prApe1 完全受保护。通过监测 GFP-Atg8（更直接的 cargo 蛋白）的蛋白酶保护实验进一步验证，npl3?细胞中形成的自噬体是完全密封的。因此，npl3?细胞中的自噬体已完成但动态活性极低。
Npl3 缺失不影响自噬体生物发生和闭合，但阻碍其与液泡融合，表明缺陷可能发生在吞噬泡密封后、自噬体 - 液泡融合之前或期间。先前研究表明，大多数参与自噬体形成的 Atg 蛋白在 PAS 或扩张的吞噬泡上富集，但在自噬体完成期间或之后立即从膜表面解离回胞质供再利用；未能从密封自噬体解离 Atg 蛋白会抑制自噬体 - 液泡融合。研究因此探究 Npl3 缺失是否影响 Atg 蛋白的有效解离和再循环，重点关注 Atg16（Atg12 结合系统的组分），它被招募到扩张的吞噬泡并从自噬体表面快速解离。通过在 Atg16 的 C 端内源标记 GFP 并在 CUP1 启动子下表达 RFP-Atg8，氮饥饿后 WT 和npl3?细胞中所有 Atg16 puncta 均与 Atg8 阳性结构共定位。检测保留 Atg16 的 Atg8 puncta 百分比，发现 WT 和npl3?细胞的共定位百分比显著低于atg2?细胞（PAS 成熟停滞，Atg 复合体解体受损），且 WT 和npl3?细胞之间无显著差异，表明缺失NPL3不影响 Atg 蛋白从 PAS 的解离或再循环。
接下来，研究想了解npl3?细胞中液泡周围的 Atg8 puncta 是否能够周转（即与液泡融合后降解）并保持动态变化，还是被困在液泡附近但在整个饥饿期间相对不变。因此，采用荧光活细胞成像追踪 GFP-Atg8，其动态模式与自噬体形成和解体相关。在 WT 细胞中，观察到 GFP-Atg8 puncta 的荧光强度周期性变化：从液泡附近出现、变亮（可能是吞噬泡扩张并积累更多 GFP-Atg8 分子）、变暗和消失（自噬体与液泡融合，GFP-Atg8 在腔中分散），随后迅速启动下一轮自噬体形成。这些细胞中大多数 puncta 的寿命（反映自噬体形成动态）在 5-10 分钟范围内。相反，在 45 分钟的活细胞成像窗口中，npl3?细胞中 GFP-Atg8 的强度相对恒定，观察到的变化极小，表明 GFP-Atg8 标记的自噬体周转显著延迟。这也表明npl3?细胞在饥饿 3 小时后看到的 puncta 可能代表分析开始时就存在的同一批自噬体，而非新合成的。此外，npl3?细胞中未观察到新 puncta 形成的显著增加，与 GFP-Atg8 胞质荧光强度增加一致，这表明现有自噬体的持续存在可能抑制新自噬体的生物发生，这种现象在线粒体自噬和过氧化物酶体自噬条件下也观察到。
为确定npl3?细胞在饥饿期间胞质 GFP-Atg8 信号增加是由于新合成 Atg8 的脂化减少还是 Atg4 对 Atg8-PE 的去脂化所致，研究首先在存在液泡蛋白酶抑制剂 PMSF（阻断液泡中 Atg8 降解）的情况下检测 Atg8-PE 水平。观察到 WT 细胞在饥饿期间积累的 Atg8-PE 比npl3?细胞多。值得注意的是，氮饥饿前npl3?细胞中的 Atg8-PE 水平已升高，且 Atg8 puncta 形成未受影响，表明初始 Atg8 脂化和早期自噬体形成完好，缺陷可能在于新合成 Atg8 的脂化。随着饥饿进展，npl3?细胞中 PAS 处自噬体的积累可能干扰后续 Atg8 脂化循环。为评估去脂化的作用，研究使用在atg4? atg8?背景中表达 GFP-Atg8?R 的菌株，Atg4 是 Atg8 初始 C 端加工（用于脂化）和随后 Atg8-PE 去脂化（允许从自噬体外表面移除）所必需的，GFP-Atg8?R 可被脂化但对 Atg4 介导的去脂化有抗性。即使在该背景下，npl3?细胞在饥饿期间仍表现出胞质 GFP-Atg8?R 信号的渐进增加，表明 Atg4 依赖的去脂化不是该表型的主要原因。这些结果支持新合成 Atg8 的脂化减少导致npl3?细胞中胞质 GFP-Atg8 积累的结论。
RRM2 结构域和核定位对 Npl3 功能至关重要
Npl3 是酵母中一种主要的异质核核糖核蛋白，在核质间穿梭，参与 mRNA 转录延伸和终止、剪接、核 mRNP 组装和输出以及翻译等多种基因表达过程。鉴于未观察到与 PAS 对应的 puncta，Npl3 在饥饿期间主要定位于核，且 Npl3 与自噬体 - 液泡融合 machinery 无已知物理相互作用，研究推测 Npl3 可能通过其 RNA 相关过程间接调控融合。
作为 RNA 结合蛋白，Npl3 包含三个 RNA 结合域：两个连续的中央 RNA 识别基序（RNA-recognition motif, RRM）和一个含 15 个精氨酸 - 甘氨酸 - 甘氨酸（RGG）重复的 C 端 RGG 基序，这些对其 RNA 加工功能至关重要。研究探究这些保守结构域是否对 Npl3 调控自噬的作用有贡献，构建了每个 RNA 结合域的截短突变体并评估其对自噬活性的影响。虽未能生成?RRM1突变体，但构建了替代突变体 Npl3F160L（缺乏功能性 RRM1）。在氮饥饿条件下，Npl3 [?RRM2] 菌株而非其他两个突变体的自噬活性与 WT 细胞相比显著降低，尽管降低程度不如完全npl3缺失严重。所有三种突变体 Npl3 蛋白的表达水平与 WT 相当，表明观察到的自噬缺陷并非由于 Npl3 表达降低。
作为穿梭蛋白，Npl3 在核和胞质中均参与过程。为确定 Npl3 在哪个区室中发挥自噬调控功能，研究使用了两种突变体：E409K（阻断核定位序列功能，阻碍 Npl3 核重入，导致其在胞质积累）和 F160L（干扰核输出信号，减缓 Npl3 进入胞质，导致核积累）。通过 Npl3-mNeonGreen 的显微镜观察证实了这些突变体的定位。值得注意的是，氮饥饿期间观察到 Npl3 的胞质定位增加和核定位减少，在 E409K 突变体中尤为明显，这表明氮饥饿可能诱导 Npl3 的核输出，类似于热休克期间观察到的应激反应。研究发现，Npl3 的核输入受损（而非输出）导致自噬活性降低，表明 Npl3 的核定位对其自噬调控功能至关重要。
为验证这些突变体中自噬活性的降低是由于自噬体 - 液泡融合受损，研究检测了氮饥饿 3 小时后 GFP-Atg8 的定位。值得注意的是，?RRM2和E409K突变体表现出明显的液泡周围 GFP-Atg8 puncta 积累，表明未能与液泡融合的自噬体积累，这一缺陷与npl3缺失菌株相似。相反，?RGG和F160L突变体的模式与 WT 细胞相似，与自噬活性测定结果一致。?RRM2和E409K菌株中液泡 GFP 信号的存在表明这些融合缺陷是部分的。这些发现表明，?RRM2和E409K突变主要通过自噬体与液泡的部分融合缺陷破坏自噬。综上，数据表明 RRM2 结构域的 RNA 结合能力和 Npl3 的核定位均通过调节自噬体 - 液泡融合对其自噬调控作用至关重要。
DISCUSSION
包括营养剥夺在内的细胞应激通常触发一系列复杂反应，在基因表达调控的所有水平上激活适应性反应。RNA 结合蛋白通过调节 mRNA 代谢的各个方面（包括转录、加工、运输、翻译和周转）显著增强蛋白质组复杂性，并构成细胞应激反应的关键层面。本研究鉴定出 Npl3 作为一种新型 RBP 自噬调控因子，Npl3 缺失导致 bulk 和选择性自噬类型的严重缺陷，原因是自噬体 - 液泡融合受损。
鉴于：（1）Npl3 主要作为 RNA 结合蛋白发挥功能；（2）其 RNA 结合域 RRM2 和核定位对其自噬作用至关重要；（3）其相互作用组中无已知的膜融合因子或自噬 machinery；（4）饥饿期间未观察到其在 PAS 处富集，研究推测 Npl3 通过其 mRNA 靶标间接调控自噬体 - 液泡融合。然而，已知融合 machinery 组分（包括 SNARE 和 HOPS 复合体）的 mRNA 水平在npl3?细胞中并未降低。由于 Npl3 参与几乎所有 RNA 代谢方面，很难精确确定其具体过程和功能，但这些功能最终都会导致 mRNA 终产物（即蛋白质）的变化。为全面了解蛋白质丰度并无偏地识别 Npl3 的潜在靶标，研究使用细胞培养
