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本文开发了脂质共轭小干扰 RNA（siRNA）的生物分析方法，通过固相萃取（SPE）结合稳定同位素标记内标（SILIS）的液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）技术，实现小鼠血浆和组织中精准定量，准确性与精密度优异，为 siRNA 生物分析提供标准化方案。
1. 引言
寡核苷酸疗法（ONTs）是一类快速发展的药物形式，包括反义寡核苷酸（ASOs）、小干扰 RNA（siRNAs）、微小 RNA（miRNAs）和适配体。从监管角度看，ONTs 既非小分子也非生物制品，美国 FDA 近期发布了针对该类分子的非临床安全性评估指导原则草案（FDA-2024-D-4624）。在 ONTs 中，ASOs、miRNAs 和 siRNAs 均利用核酸互补性实现靶转录本的降解，但其机制略有不同。
早期 ONTs 的市场化努力主要集中在 ASOs，其通过剪接调控或 RNA 酶 H 依赖的降解作用实现靶转录本降解，如 1998 年获批的首个寡核苷酸药物福米韦生就属于 ASO 类。20 年后，帕替拉生获批用于治疗遗传性转甲状腺素淀粉样变性（hATTR），成为首个小干扰 RNA（siRNA）疗法，开启了 siRNA 药物获批的新纪元，目前已有多款 siRNA 药物获批，且随着分子稳定性和靶向性的显著提升，未来将有更多药物进入市场。
siRNA 疗法不同于 ASOs，其利用 Fire 和 Mello 于 1998 年在线虫C. elegans中发现的进化保守内源基因调控机制（两人因此获 2006 年诺贝尔奖）。简而言之，外源引入的完美碱基配对双链 RNA（dsRNA）在细胞内被 Dicer 蛋白处理，反义链（引导链）在 Dicer 帮助下装载到 RNA 诱导沉默复合体（RISC）中，该复合体包含 Argonaute 核酸酶及辅助因子。当装载 siRNA 的 RISC 复合体与互补 mRNA 结合后，靶转录本通过类 RNA 酶 H 的内切核酸机制被降解。
无论采用哪种 ONT 形式，该领域面临两个关键挑战：一是优化组织特异性递送，二是实现细胞摄取。关于组织特异性递送，在肝脏外实现高效的组织或细胞类型特异性靶 mRNA 敲除是学术界和制药研发的研究热点，这能显著降低脱靶效应并改善药物安全性。肝脏递送在 siRNA 领域较早取得成功，一方面是由于包裹的 siRNA 在肝脏的固有被动积累，另一方面是因为肝脏高表达的去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）可介导 N - 乙酰半乳糖胺（GalNAc）修饰 siRNA 的摄取，且该受体周转率高，有助于药物吸收。寻找类似 ASGPR 的其他组织或细胞类型受体（高表达、特异性及高周转率）是 siRNA 疗法的重要里程碑，目前已有一定进展，如转铁蛋白受体被提议作为反义寡核苷酸（ASO）疗法向中枢神经系统（CNS）递送的途径，但转铁蛋白受体（TfR1）在其他组织也有较广泛表达，例如 TfR1 抗体 - 寡核苷酸偶联物（AOCs）在骨骼肌中表现出强敲除活性。
关于细胞摄取，内体逃逸是固有局限。siRNA 需从内体逃离至细胞质才能发挥作用，而内体通常会将货物循环至细胞表面或转运至溶酶体降解，这两种结果均无法实现有效的靶转录本沉默。尽管内体反向融合可能是 siRNA 逃逸的潜在机制，但目前尚未发现可利用该途径实现 ONT 内体逃逸的方法，内体逃逸效率在大多数细胞类型中估计低于 1%，解决该问题将极大提升 ONT 的效力。
研究性新药（IND）申请需要了解药物在动物临床前模型中的药代动力学和毒代动力学参数，ONTs 也不例外。这些参数通常通过液相色谱 - 质谱（LC-MS）测定，即检测生物样品中药物及其代谢物的浓度。然而，ONTs 的新型化学修饰带来了生物分析挑战。修饰 siRNA 的生物分析挑战主要出现在 LC-MS 分析之前，因为反义链的化学组成相对稳定。反义链的 bulky 化学修饰可能干扰 Argonaute 结合和核酸酶切割，因此化学修饰（如长链脂肪酸）通常连接在正义链（过客链）上，因为 RISC 结合对空间位阻非常敏感。近期研究探索了不同碳链长度的脂肪酸偶联物用于增强肝外递送，例如有研究表明二十二烷酸可实现向骨骼肌和心肌的递送。长链饱和脂肪酸修饰会显著增加疏水性，这可能改变目标分析物的提取回收率和选择性（尤其对于液 - 液萃取（LLE）或反相固相萃取（SPE）等方法），但同时也可能提高 SPE 中有机洗涤步骤的耐受性，减少干扰离子。
在寡核苷酸生物分析领域，由于稳定同位素标记内标（SILIS）合成困难且成本高，类似物内标一直占主导地位。寡核苷酸多反应监测（MRM）实验中分析物的高电荷态意味着简单的 D3标记内标不足，单位分辨率质谱仪上分析物与内标的信号串扰不可接受。但若多数核苷酸碱基被氘标记，可使分析物与内标间形成足够的质量差以减轻串扰问题。不过，氘标记可能带来氘效应，即由于 C-H 与 C-D 键振动能差异，内标的保留时间可能早于分析物。但本研究发现保留时间变化极小（见结果部分）。
本文报道了一种用于定量脂质共轭 siRNA 候选药物的生物分析方法，采用 SILIS 定量策略（该方法在寡核苷酸生物分析领域应用较少），并提议其应成为受监管寡核苷酸生物分析的标准程序。最后，将该方法应用于小鼠早期发现药代动力学研究，以构建血浆药代动力学曲线并确定组织暴露量和反义链代谢情况。
2. 方法
2.1. 试剂与设备
本研究使用的 siRNA 是一种 proprietary 脂质共轭双链 siRNA，具有混合磷酸酯 - 硫代磷酸酯骨架，脂质修饰位于双链的过客链。脂质共轭 siRNA 双链参考物质（NN-siRNA-01）及氘标记内标（NN-siRNA-02）均为内部合成。RNA 干扰寡核苷酸的合成采用固相寡核苷酸合成方法（如美国专利 5,804,683 等所述），通过固相亚磷酰胺化学合成 RNA 寡核苷酸，脱保护后使用 Amicon? Ultra-15 离心过滤器 3K（MilliporeSigma）结合 UltraPure?无 DNase/RNase 蒸馏水（Thermo Scientific）分离纯化。
实验使用 HPLC 级乙腈和甲醇，醋酸铵、乙二胺四乙酸铵（EDTA）、N,N - 二异丙基乙胺（DIPEA）和 1,1,1,3,3,3 - 六氟 - 2 - 丙醇（HFIP）购自 Sigma-Aldrich，Ambion 无核酸酶水购自 Invitrogen。使用 Waters Acquity 寡核苷酸 BEH C18 柱（130 ?，1.7 μm，2.1×50 mm），预装 Vanguard-FIT C18 保护柱以延长柱寿命。Waters 的 Oligoworks SPE 微洗脱板试剂盒（186010614）、0.5 M 三 (2 - 羧乙基) 膦盐酸盐（TCEP HCl 186,010,612）、6 M 盐酸胍（186010601–3）、RapiZyme 蛋白酶 K 溶液（186010601–1）及微洗脱 WAX 板（186002500）均购自 Waters。空白小鼠 K2EDTA 血浆和组织购自 BioIVT。SPE 的上样、洗涤和洗脱步骤使用 Agilent 真空 manifold，样品和溶剂转移使用 Integra MINI 96 移液工作站。质谱分析采用 Sciex API 6500+ QTRAP 质谱仪，搭配 Analyst 1.7.3（hotfix 3）软件和 Agilent 1290 Infinitylab 液相色谱系统。
2.2. 标准品与内标储备液、校准标准品及质控样品的制备与储存
将冻干的分析物和内标参考物质在低吸附聚丙烯管中用 Ambion 无核酸酶水复溶至终浓度 1.0 mg/mL，于 - 20°C 储存。校准品和质控样品的独立标准工作液（SWS）在 1.5 mL 低吸附螺口管中制备，浓度为 40 μg/mL，于 - 20°C 储存。8 点标准曲线在小鼠 K2EDTA 血浆或混合组织匀浆（ adipose、心脏、肾脏、肝脏、股四头肌和脾脏的 10% w/v 匀浆按 1:1:1:1:1:1 比例混合，匀浆介质为 20% Clarity OTX 裂解上样缓冲液）中新鲜制备，通过系列稀释获得 10–1000 ng/mL 的曲线范围。血浆或混合组织匀浆中制备四个质控水平：低质控（LQC）30 ng/mL、中质控（MQC）300 ng/mL、高质控（HQC）750 ng/mL 及稀释质控（Dilution QC）100 μg/mL（稀释 200 倍后终浓度 500 ng/mL）。基质中的质控样品于 - 80°C 储存，校准标准品新鲜制备，不冷冻。
2.3. 样品提取
使用 Waters OligoWorks SPE 微板试剂盒（货号 186010614）提取样品。简要步骤：用空气置换移液枪将 100 μL 样品分装至 96 孔低吸附塑料板的每个孔中，然后用 Eppendorf M4 重复移液枪加入 10 μL 内标工作液。接着加入 TCEP 和盐酸胍进行蛋白质还原和变性，再加入蛋白酶 K 溶液进行蛋白水解。样品在 Eppendorf thermomixer 中 65°C、1000 rpm 条件下消化（血浆 1 小时，组织 2 小时）。之后，样品在水平转子离心机中以 1000 rcf 离心 5 分钟，用 96 通道移液枪将全部样品转移至 SPE 微板，通过 Agilent 真空 manifold 在低真空下上样。SPE 板在中等真空下先用 200 μL 50 mM 醋酸铵水溶液洗涤一次，再用 40% 甲醇水溶液洗涤一次。样品在低真空下用两次 50 μL Oligoworks SPE 洗脱液（186010610）依次洗脱，最终 100 μL 洗脱液用 100 μL Ambion 无核酸酶水稀释后进行 LC-MS 分析。
2.4. IP-RP UHPLC-MS 分析
使用 Agilent 1290 系统耦合 Sciex 6500+ QTRAP 质谱仪进样 5 μL 复溶样品。自动进样器模块设为 10°C 以延长重进样稳定性。色谱柱为 Waters Acquity 寡核苷酸 BEH C18 柱（130 ?，1.7 μm，2.1×50 mm），配备 Waters Acquity premier oligo BEH C18 预柱（130 ?，1.7 μm，2.1×5 mm），柱温 75°C。流动相 A 为 90:10 水：甲醇，含 1% HFIP、0.25% DIPEA 和 2.5 μM EDTA 铵盐（减少钠加合物形成）；流动相 B 为 70:20:10 甲醇：乙腈：水，含 1% HFIP、0.25% DIPEA 和 2.5 μM EDTA 铵盐。梯度程序（流速均为 0.300 mL/min）：初始条件 5% B；0.50 分钟 10% B；2.50 分钟 15% B；5.00 分钟 25% B；6.00 分钟 95% B；7.00 分钟 95% B；7.10 分钟 5% B；8.50 分钟 5% B。质谱配备切换阀，0.0–3.0 分钟和 6.0 分钟后将流路切换 away from 质谱，以减少仪器污染。质谱采用低质量负电喷雾离子化（ESI）模式，源参数设置：气帘气 40 psi，离子喷雾电压 - 4000 V，温度 400°C，气体 1（GS1）50 psi，气体 2（GS2）50 psi，去簇电压 - 110 V。
2.5. 小鼠研究设计与动物使用减少
本研究共使用 3 只小鼠收集体内数据。小鼠皮下注射 15 mg/kg NN-siRNA-01。除 48 小时终末时间点通过心脏穿刺收集约 500 μL 血液外，其余时间点通过尾静脉微量采样收集约 35 μL 血液（可获得≥10 μL 血浆）。终末时间点还收集组织（脂肪、心脏、肝脏、肾脏、股四头肌和脾脏），称重后在干冰上冷冻。生物样品在收集时立即置于干冰上冷冻，随后储存在 - 80°C 直至分析（体内研究中， assay 修改为使用 10 μL 血浆 aliquots）。
3. 结果
3.1. NN-siRNA-02：siRNA 稳定同位素标记内标
本研究旨在评估稳定同位素标记内标定量方法在 siRNA 生物分析中的可行性。类似物内标具有优势：一是 SILIS 合成成本高且困难，二是类似物内标核酸分子与目标分析物的理化性质相似。但类似物内标无法完全解决分析物与内标间基质效应差异的问题。鉴于此，本研究合成并测试了针对 NN-siRNA-01（一种具有混合磷酸酯 - 硫代磷酸酯骨架的 proprietary 脂质共轭 siRNA）的 SILIS（NN-siRNA-02）的生物分析性能。NN-siRNA-02 是氘标记的长链脂肪酸共轭双链 siRNA，与 NN-siRNA-01 具有相同的核苷酸碱基序列。在固相寡核苷酸合成过程中，使用 2'-O-(甲基 - d3)- 腺苷、2'-O-(甲基 - d3)- 胞苷、2'-O-(甲基 - d3)- 鸟苷和 2'-O-(甲基 - d3)- 尿苷将氘原子引入 SILIS。
3.2. NN-siRNA-02 的质谱表征
获得参考物质后，在 6500+ QTRAP 质谱仪的调谐模式下评估 SILIS 的电离和碎裂参数。寡核苷酸生物分析因分析物多电荷态导致信号稀释，以及多种潜在同位素体（最丰度同位素体通过同位素簇最丰峰位置（LAPIC）方法计算）而变得复杂。本研究聚焦于 [SILIS 的 M-9H] 前体离子，其 LAPIC 质量为 821.6，对应分析物的 LAPIC 质量为 816.8。在碰撞能量梯度产物离子扫描中，低碰撞能量下可检测到计算质量（几乎无碎裂），高碰撞能量下观察到共享或质量偏移的碎片离子。由于 SILIS 的多个 2'- 甲氧基部分带有三个氘原子，可观察到共享的硫代磷酸酯（95.0，精确质量 94.94 Da）和磷酸酯（79.0，精确质量 78.96 Da）碎片离子。正如预期，分析物中对应核苷糖 - 磷酸碎片的离子（207.2，精确质量 207.01 Da）在 SILIS 中表现出 3 Da 质量偏移（210.2，精确质量 210.03 Da）。后续生物分析选择硫代磷酸酯（95.0）跃迁，这是实验室标准操作，能在选择性和仪器响应间取得最佳平衡。与 SILIS 和对应分析物理化性质几乎相同一致，SILIS 的调谐参数与分析物完全相同。优化后，在 MRM 模式下注入 5 μg/mL 的分析物和内标混合调谐溶液，观察到相似的仪器响应，分析物跃迁信号约为 6.0e4 cps，内标跃迁信号约为 7.0e4 cps。
接下来评估内标在纯水溶液中的色谱性质，采用离子对反相（IP-RP）色谱（寡核苷酸生物分析的当前标准方法）。流动相含 1% HFIP 和 0.25% DIPEA（离子对试剂）。令人惊讶的是，分析物和内标的保留时间均约为 4.0 分钟（±0.4 分钟）。尽管内标含有 42 个氘原子，但未观察到显著的氘效应（通常氘标记内标因 C-D 键与 C-H 键的键能和疏水性差异会更早保留）。推测寡核苷酸内标氘效应可忽略的原因是 IP-RP 的保留机制依赖于内标与固定相通过离子对试剂桥接的间接疏水相互作用，C-D 键对保留机制贡献极小，因此无明显氘效应，这与之前在 HILIC 色谱中因极性保留机制导致氘效应可忽略的发现一致。
3.3. WAX μSPE 回收率优化
在优化 NN-siRNA-02 的 assay 过程中，研究评估了 μSPE 方案在第二次洗涤步骤中是否能耐受更高比例的有机溶剂。理由是 WAX 色谱中的强离子相互作用可防止分析物在更严格的有机洗涤条件下被洗脱，同时非阴离子、非极性污染物可在第二次洗涤步骤中更有效洗脱。结果显示，在测试的 20% 至 100% 甲醇浓度范围内，回收率相似，完全省略甲醇时回收率略高（90% vs. 72–82%）。后续提取中，第二次洗涤步骤使用 40% v/v 甲醇。
3.4. 分析范围与选择性
评估了内标的 D0 贡献（即仅内标纯品进样中可检测到的分析物信号），D0 贡献稳定在 0.5–1.0%。例如，内标峰面积为 3.00e6 cps 时，分析物峰面积为 1.81e4 cps，占内标通道信号的 0.6%。为确定分析物在内标通道的信号是来自参考物质中的杂质还是单位分辨率三重四极杆质谱仪的共隔离，在 ThermoFisher Orbitrap QE-HF 高分辨率质谱仪（HRMS）上对纯内标样品进行测试进样，观察到的 D0 信号占内标峰面积的 0.88%，表明信号来自参考物质中的杂质。由于内标中的 D0 信号，最终曲线范围确定为 10–1000 ng/mL，符合 ICH M10 指南中干扰成分响应不超过定量下限（LLOQ）信号 20% 的要求。
3.5. 小鼠血浆和组织中的分析范围与准确度、精密度
通过三次独立实验评估 SILIS 的分析性能，在血浆和组织匀浆中进行准确度和精密度测试，采用弱阴离子交换（WAX）固相萃取试剂盒提取分析物和 SILIS。标准曲线为 8 点（10、20、40、80、100、400、800、1000 ng/mL），采用 1/x2线性拟合，在小鼠 K2ETDA 血浆和混合组织匀浆中均显示良好线性，无因非特异性结合导致的反向二次趋势或检测器饱和导致的二次趋势。四个质控水平（LQC 30 ng/mL、MQC 300 ng/mL、DilQC 500 ng/mL、HQC 750 ng/mL）在血浆中的定量值均在标称值的 10% 以内，在组织匀浆中的定量值均在标称值的 5% 以内。尽管组织样品中分析物响应有明显抑制，但血浆标准品在组织中所有质控水平的定量结果仍优异。幸运的是，基质效应对分析物和内标的影响通常是均等的，因此即使在具有不同基质效应的不同基质中也能实现稳健定量。
3.6. NN-siRNA-01 在小鼠体内药代动力学和组织暴露的初步评估
将验证后的 assay 用于 CD-1 小鼠模型的药代动力学和组织暴露参数测定。雌性 CD-1 小鼠皮下注射 15 mg/kg NN-siRNA-01，使用毛细管微量采样装置在 10 分钟、20 分钟、30 分钟、1 小时、2 小时、4 小时、8 小时和 24 小时收集血液（足够获得≥10
