编辑推荐：
本文研发的 3D 打印多通道抽吸装置，为血沉棕黄层（buffy coat）收集提供低成本方案。其 8 个径向通道可高效获取该层，循环肿瘤细胞（CTCs）回收率达 89%-98%，红细胞污染少，兼容常规设备，助力临床与科研中 rare 细胞检测。
1. Introduction
当抗凝全血经过离心处理后，会分离成三个明显的层次。上层是血浆，在正常人体内约占血液体积的 55%；下层是红细胞，占剩余的 45%；而介于两者之间的是一层薄薄的、呈奶油白色的血沉棕黄层，占比不到 1%，其中几乎包含了所有的白细胞和血小板。在多种病症和疾病状态下，血液中会循环存在一些罕见的外来或异常细胞，离心后这些细胞也会在血沉棕黄层中分层。外来细胞包括妊娠期的胎儿滋养细胞以及利什曼原虫等寄生虫；异常细胞则有感染性白细胞（如在无形体病中）和循环肿瘤细胞（CTCs）。通过聚合酶链反应（PCR）、流式细胞术或差异染色等方法对这些罕见细胞进行检测和表征，在实验诊断医学中具有重要意义。
从血液收集管中完整或部分获取血沉棕黄层并非易事，过程中容易破坏或丢失目标罕见细胞，还可能受到大量红细胞的污染。常用的简单移液和基于聚蔗糖（Ficoll）的分离技术效果并不理想。RareCyte 公司开发的方法虽稳健有效，但需要专用仪器，这在一定程度上限制了其普及和应用。本文介绍了一种新型多通道抽吸装置，可高效收集血沉棕黄层，并以循环肿瘤细胞检测为例展示了其广泛的实用性。目前该装置虽仅制作了 3D 打印原型，但大规模生产相对简单，有望成为满足多种临床和研究需求的低成本选择。
该装置采用 3D 打印手术树脂制成，拥有 8 个直径为 2mm 的通道，呈放射状排列。这种设计能在离心后与血沉棕黄层形成较大的表面积接触。由于移液器的负压分布在多个小直径通道上，能够以温和且精确控制的方式抽吸血沉棕黄层，减少血沉棕黄层与相邻红细胞的混合，同时保护脆弱的循环肿瘤细胞。实验表明，即便循环肿瘤细胞以极低浓度掺入，该装置也能实现较高的循环肿瘤细胞回收率。
2. Methods
2.1. Blood sample collection
用于掺入实验的全血通过常规外周静脉采血从健康志愿者处收集，每个样本 4mL。血液被吸入添加乙二胺四乙酸（EDTA）的 Vacutainer?管中以防止凝固，确保离心时血液成分能够顺利分离。
2.2. Spike-in cell line preparation
为模拟循环肿瘤细胞，实验使用了 H929 骨髓瘤细胞系（来自美国典型培养物保藏中心，ATCC）的染色细胞，这些细胞用线粒体荧光染料 MitoTracker? Deep Red FM（Invitrogen）进行标记。这种染料具有细胞渗透性，是线粒体特异性染料，能被动扩散进入活细胞并在活跃的线粒体中积累。固定后仍能较好地保留，且不会影响细胞活力，可通过 CyteFinder?等设备进行可视化观察。
2.3. Preparation of control and spike-in samples
为模拟不同浓度下循环肿瘤细胞的检测情况，将经染色的 H929 骨髓瘤细胞制备成三种掺入浓度水平，分别为 300、30 和 12 个细胞 /mL，对应高、中、低浓度。选择这些浓度是为了反映在浆细胞疾病（包括多发性骨髓瘤）中临床观察到的循环肿瘤细胞频率范围。近期文献报道，在冒烟型骨髓瘤中循环肿瘤细胞水平可低至约 50 个细胞 /mL，而在新诊断病例中则可超过 600 个细胞 /mL。
使用 Countess II 自动细胞计数器对初始循环肿瘤细胞数量进行计数。对于每个掺入浓度，通过在缓冲液（含 2% 牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲盐水（PBS））中掺入相应浓度的 H929 细胞，制备三份对照玻片。这些对照玻片不经过血沉棕黄层收集过程，作为标准与分离后的掺入血液样本进行比较，从而能够准确计算不同细胞浓度下的回收率。
2.4. Buffy coat collection from spike-in samples
为分离血沉棕黄层，将 EDTA 抗凝全血样本在摆动式转头离心机中以 1000×g 的离心力离心 10 分钟，且离心结束时不使用制动。这一步骤能形成明显的分层，使血沉棕黄层恰好位于红细胞上方、血浆下方。离心后，用标准移液器小心移除血浆层。将 3D 打印多通道抽吸装置连接到 Drummond Pipet-Aid? 控制器上，然后将其放入试管中接触血沉棕黄层，轻轻施加吸力进行抽吸。整个过程通过视觉监控，以确保血沉棕黄层被完全移除，同时最大程度减少相邻红细胞的污染。
随后，将装载有样本的装置转移到含有仅添加 2% BSA 的 PBS 的 SepMate?-15 管中，再次以 1000×g 的离心力离心，使装置中的血沉棕黄层完全排出并形成细胞沉淀。使用 SepMate?-15 管是为了提供一个屏障，防止装置在离心过程中沉到沉淀中。对于选定的样本，整个过程会重复进行，以重新形成并收集任何残留的血沉棕黄层，同一样本的沉淀会在分析前合并。
2.5. Isolation and staining of buffy coat from clinical samples using 3D printed multichannel device
在纽约生物医学研究联盟机构审查委员会批准的研究方案（研究编号：15-08-28-337）下，该 3D 打印多通道抽吸装置还被用于收集几名新诊断的多发性骨髓瘤（MM）和意义未明的单克隆丙种球蛋白病（MGUS）患者的血沉棕黄层，所有参与者均签署了书面知情同意书。在获得知情同意后，使用含 EDTA 抗凝剂的 Vacutainer 管（Becton Dickinson，目录号 367861）收集血液。按照 2.4 节中描述的方法从这些患者样本中收集血沉棕黄层。
通过一组特异性抗体的荧光染色来表征循环肿瘤细胞的存在，具体包括：用 AF?647 标记的抗 CD138 抗体（Biolegend，目录号 356524）、用 AF?488 标记的抗 CD56 抗体（Biolegend，目录号 304611）、用 Qdot?800 标记的抗 CD8 抗体（Invitrogen，目录号 Q22157）以及用藻红蛋白（PE）标记的抗 BCMA 抗体（Biolegend，目录号 357503）。CD138 是浆细胞表面的一种蛋白质，是多发性骨髓瘤的主要诊断生物标志物；B 细胞成熟抗原（BCMA）在恶性浆细胞上广泛表达；CD56 有助于进一步区分正常和异常浆细胞；而 CD8 主要是细胞毒性 T 细胞的标志物，通常不在浆细胞上表达，因此是该抗体组合中的良好阴性标志物。
收集到的细胞随后在黑暗环境中，室温下与 200μL 含 2% BSA 的 PBS 孵育 1 小时，其中含有 17μL 的 CD138、CD56、BCMA 抗体，1μL 的 CD8 抗体以及 1μL 的 4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚（DAPI）。孵育后，按照 2.6 节中描述的方案对细胞进行固定。将染色后的血沉棕黄层重悬于 800μL 细胞染色缓冲液中，每个玻璃显微镜载玻片上滴加 100μL 样本。
2.6. Quantification of buffy coat cells
为进行固定和染色，将细胞沉淀重悬于红细胞裂解 / 固定溶液（BioLegend，目录号 422401）中，按照每 200μL 样本体积加入 2mL 溶液的比例混合，孵育 15 分钟。孵育后，将样本以 500×g 的离心力离心 5 分钟，小心移除上清液。然后按照与裂解溶液相同的比例加入细胞染色缓冲液，再次以 500×g 离心。弃去上清液后，即可获得红细胞污染极少的血沉棕黄层沉淀。
为进一步分析，将血沉棕黄层重悬于 800μL 缓冲液中，每个玻璃显微镜载玻片上滴加 100μL 样本。
3. Results
3.1. High-Efficiency recovery of spiked in CTCs using the 3-D printed multichannel aspiration device
利用自动化 CyteFinder?系统对回收的掺入循环肿瘤细胞进行计数。通过细胞核（DAPI 染色）和阳性线粒体荧光（MitoTracker 染色）来确认掺入的循环肿瘤细胞。
该装置在不同掺入浓度（12、30 和 300 个细胞 /mL）下均展现出稳定且高效的循环肿瘤细胞回收能力。对于每个循环肿瘤细胞浓度，通过 8 个样本的重复掺入实验来评估装置的重现性和性能，每个掺入水平均进行重复回收评估，测试条件如下：
- 12 个细胞 /mL 的掺入样本仅使用该装置进行一次回收测试。
- 30 个细胞 /mL 的掺入样本连续使用该装置进行两次回收测试。
- 300 个细胞 /mL 的掺入样本则在两种条件下进行测试，即使用装置一次和连续使用装置两次。
结果显示，在所有浓度下均获得了优异的回收率，无论装置使用一次还是连续使用两次，效果都较为理想。
在另一项对比分析中，选取 10 份患者样本，在相同条件下分别使用多通道装置和标准移液管收集血沉棕黄层。使用 Sysmex XN-10 自动分析仪测量白细胞浓度，将其作为血沉棕黄层回收率的便捷替代指标。结果显示，该装置回收的白细胞浓度始终更高，与移液管相比平均增加 1.8 倍（回收率提高 82%）。通过威尔科克森符号秩检验（Wilcoxon signed-rank test），该差异具有统计学意义（p = 0.01086），证实该装置能提高回收率。
3.2. Visualization of CTCs from clinical samples obtained with novel device
借助 Cytefinder?扫描仪和软件算法，可对使用 3D 打印装置从多发性骨髓瘤和意义未明的单克隆丙种球蛋白病患者样本中分离出的循环肿瘤细胞进行自动化识别，该算法能识别表达特定组合荧光表面标志物的细胞。循环肿瘤细胞通过细胞核（DAPI 染色）、CD138、CD56 和 BCMA 阳性染色以及 CD8 荧光阴性来确认。在多发性骨髓瘤和意义未明的单克隆丙种球蛋白病患者的血液中均检测到了循环肿瘤细胞。在一名新诊断且未经治疗的多发性骨髓瘤患者的血液中，平均每毫升血液中可检测到 342 个循环肿瘤细胞；而在一名意义未明的单克隆丙种球蛋白病患者中，平均每毫升血液中检测到 25 个循环肿瘤细胞。不同患者的循环肿瘤细胞数量会因个体差异、疾病状态和检测方法的不同而有很大差异。
4. Discussion
本研究证实了 3D 打印多通道抽吸装置在血沉棕黄层收集方面的有效性，尤其适用于需要回收循环肿瘤细胞等罕见循环细胞的应用场景。实验表明，该装置对不同浓度的循环肿瘤细胞回收率可达 89% 至 98%，即使在 12 个细胞 /mL 的低掺入水平下也表现出色。值得注意的是，12 个循环肿瘤细胞 /mL 的浓度处于预测癌症复发和进展的临床意义范围内。该装置设计简单，且与标准实验室设备（如 Drummond Pipet-Aid? 控制器）兼容，对于缺乏昂贵专用设备的实验室而言，是一种可扩展、易获取的解决方案。对于有移液管制造专业知识的公司来说，采用模具而非 3D 打印的方式大规模生产该装置并非难事。由于无需添加密度梯度等试剂，该方法适用于多种下游分析，包括免疫组织化学、核酸扩增技术和细胞培养等。
本研究的数据可视为 “概念验证”。通过以下方式有望进一步优化回收率：一是增加装置通道数量并减小通道宽度；二是采用冲洗装置的方式替代离心来获取血沉棕黄层；三是实现抽吸步骤的自动化以精确控制流动动力学。减少湍流对于循环肿瘤细胞相关应用尤为重要，因为这类细胞已知非常脆弱。此外，本研究使用的是常用于循环肿瘤细胞分析的 EDTA 抗凝全血，但抗凝剂的选择可能会影响血沉棕黄层的分离和罕见细胞的回收。未来的研究将探索该装置在其他抗凝剂（如肝素和柠檬酸钠）中的性能，以确定抗凝剂类型是否会对细胞回收率、红细胞污染或循环肿瘤细胞完整性产生影响。
我们认识到流式细胞术是细胞识别和定量的强大工具，但在检测低频率（<10 个细胞）的罕见循环肿瘤细胞时，其灵敏度阈值存在局限。
综上所述，3D 打印多通道抽吸装置为血沉棕黄层收集提供了一种创新的低成本解决方案，具有较高的回收率且能保持细胞完整性。其简单的设计使其成为多种研究和临床应用的有力工具。随着进一步优化和大规模生产，该装置有望通过在各种临床环境中实现罕见循环细胞的低成本检测和表征，推动实验诊断医学的发展。
5. Future perspective
在未来 5-10 年，罕见细胞检测领域预计将越来越注重可及性、自动化以及与临床诊断的整合。随着液体活检平台的不断发展，人们将更关注能够分离完整、有活力的循环肿瘤细胞的方法，而不仅仅是无细胞脱氧核糖核酸（DNA）。目前大多数循环肿瘤细胞研究集中在基因组分析，但收集完整细胞对于蛋白质组学和表型分析将变得至关重要，尤其是对于那些无法通过核酸测序捕获的标志物。对表面和细胞内蛋白质生物标志物的分析将有助于更全面地了解肿瘤异质性、治疗耐药性和微小残留病。
像本文所述的多通道抽吸装置这类能够保持细胞形态并实现高效回收的技术，恰好能够满足这一不断发展的需求。预计这些工具将与下游的多重染色平台、自动化成像和细胞学分析相结合。随着装置生产从 3D 打印转向可扩展的注塑成型，这类工具可能会得到广泛应用，特别是在资源有限、先进细胞分选技术难以普及的地区。最终，罕见细胞诊断的未来将由兼具简便性和生物保真度的解决方案所塑造。
Ethical declaration
涉及人类参与者的研究方案和知情同意书（ICF）已通过纽约生物医学研究联盟机构审查委员会的审查和批准（研究编号：15-08-28-337）。根据伦理准则和规定，所有参与者在纳入研究前均签署了书面知情同意书。
Author contributions
概念构思：Paul Fiedler；方法学：Lisa Arrigo、Jennifer Campbell、Paul Fiedler；研究实施：Lisa Arrigo、Jennifer Campbell；形式分析：Paul Fiedler、Lisa Arrigo；可视化：Kyle Hardy；原始稿件撰写：Kyle Hardy、Paul Fiedler、Jacob Fiedler、Lisa Arrigo；稿件审阅与编辑：Kyle Hardy、Lisa Arrigo、Paul Fiedler；监督：Paul Fiedler。
Reviewer disclosures
本手稿的同行评审专家没有相关的财务或其他需要披露的关系。
