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本文聚焦 IgA 肾病（IgAN）治疗难题，通过网络药理学与转录组学结合实验验证，揭示归芪益肾颗粒（GQYS）可降低蛋白尿、改善肾病理损伤。其机制在于抑制 TLR4/MyD88/NF-κB 和 IL-6/JAK2/STAT3 通路，为 GQYS 临床应用及 IgAN 新疗法提供有力依据。
Abstract
背景：IgA 肾病（IgA nephropathy, IgAN）是导致肾衰竭和死亡的重要原因，治疗选择有限。归芪益肾（Gui-qi-yi-shen, GQYS）颗粒是治疗 IgAN 的经典中药方剂，但其潜在分子机制尚不明确。
目的：阐明 GQYS 在 IgAN 治疗中发挥疗效的机制。
材料与方法：将 8 周龄 Itgam-IRES-hCD89 小鼠分为 IgAN 组、GQYS 低剂量组（GQYS-L，5.2 g/kg）、GQYS 高剂量组（GQYS-H，10.4 g/kg）和氯沙坦组（6.5 mg/kg），以同期 C57/BL6 小鼠作为对照组。采用过碘酸 - 希夫（Periodic acid-Schiff, PAS）染色、生化分析和免疫荧光（immunofluorescence, IF）进行疗效评价；通过网络药理学和转录组学分析探究 GQYS 的潜在机制，并采用蛋白质印迹法和 IF 进行验证。
结果：与模型组相比，GQYS 组的 24 小时蛋白尿和丙氨酸转氨酶水平显著降低。PAS 染色显示，IgAN 小鼠存在肾小球系膜细胞增生和基质扩张，而 GQYS 组的这些病理改变得到缓解。IF 结果显示，与模型小鼠相比，GQYS 减少了肾小球系膜区 IgA 和 C3 的沉积。网络药理学和转录组学分析鉴定出可能与 GQYS 抗 IgAN 作用相关的基因和通路。蛋白质印迹法和 IF 结果表明，GQYS 可降低 TLR4/MyD88/NF-κB 和 IL-6/JAK2/STAT3 信号通路相关蛋白的表达。
结论：GQYS 通过 TLR4/MyD88/NF-κB 和 IL-6/JAK2/STAT3 信号通路减少 IgAN 小鼠的蛋白尿并改善肾脏病理损伤，为 IgAN 提供了一种有前景的治疗策略。
Introduction
IgA 肾病（IgAN）是全球最常见的原发性肾小球肾炎。在确诊后的 20-25 年内，约 30-45% 的 IgAN 患者会进展为终末期肾病（end-stage renal disease, ESRD）。过去，IgAN 的治疗主要依赖支持治疗，免疫抑制疗法虽有效，但受限于副作用。近年来，几种新的靶向药物已获批用于 IgAN 治疗，包括 SGLT-2 抑制剂、肠道靶向布地奈德（Nefecon）、内皮素受体拮抗剂和补体抑制剂。然而，现有治疗在疗效、副作用和适用性方面仍存在诸多限制。因此，迫切需要寻找有效的干预措施来延缓 IgAN 进展，进而减少 ESRD 的发生。临床实践表明，中医药在减少慢性肾病患者蛋白尿、减轻肾脏炎症和纤维化方面具有活性。
归芪益肾（GQYS）颗粒源于积雪草复方，是国医大师王永钧研制的临床方剂。该方剂由五种中药组成：积雪草、黄芪、大黄、桃仁和当归（中国专利申请号：200510048997.9），已获批为医院制剂（浙药制字：Z20240001000）。其组方基于益气养血、活血化瘀、消症散结、祛风除湿的原则，与 IgAN 的主要证候和病机相符。临床应用 GQYS 治疗 IgAN 已取得积极疗效，但具体作用机制仍需深入的基础研究来阐明。
本研究采用 Itgam-IRES-hCD89 转基因小鼠探究 GQYS 对 IgAN 的作用，该小鼠可模拟人类 IgAN 的病理特征，包括肾小球系膜区 IgA 沉积、系膜基质扩张和轻度蛋白尿，与经典的 CD89 转基因小鼠相似。通过结合网络药理学、转录组学分析和实验验证，发现 GQYS 主要通过抑制 TLR4/MyD88/NF-κB 和 IL-6/JAK2/STAT3 信号转导通路来预防 IgAN 小鼠的肾脏损伤。
Materials and Methods
Reagents and Drugs
GQYS 由杭州市中医院中药房提供；氯沙坦钾片由默克夏普 & 多姆有限公司提供（批准文号：HJ20171081，杭州）。
其他材料包括：PAS 染色试剂盒（G1281，批号：No.2306001，Solarbio）、Alexa Fluor?488 标记的山羊抗小鼠 IgA（1040–30，SouthernBiotech，美国阿拉巴马州伯明翰）、FITC 标记的山羊抗小鼠 C3（0855500，MP Biomedicals，美国加利福尼亚州欧文）。所用抗体如下：TLR4（19,811-1-AP，Proteintech）、NF-κB p65（10,745-1-AP，Proteintech）、磷酸化 NF-κB p65（10,745-1-AP，Proteintech）、MyD88 抗体（ab219413，Abcam）、IL-6（A0286，Abclonal）、JAK2（ET1607-35，HUABIO）、STAT3（AF1492，Beyotime）、磷酸化 STAT3（ET-1607-39，HUABIO）、GAPDH（60004-1-Ig，Proteintech）、山羊抗兔 / 小鼠 IgG 二抗（926–32,210/926-68071，LI-COR，美国）、Alexa Fluor? Plus 488 标记的驴抗兔 IgG（H+L）（Invitrogen，A32790）和 DAPI（ab104139，Abcam）。
Component Analysis
采用超高效液相色谱 - 四极杆飞行时间串联质谱（ultra-high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UPLC-Q-TOF-MS/MS）对 GQYS 的化学成分进行鉴定。简要步骤：精确称取 GQYS 颗粒 1 g，用超纯水溶解并稀释至 20 mg/mL，溶液经 0.22 μm 滤膜过滤后进样分析。使用 7600 ZenoTOF 高分辨质谱仪（AB Sciex，美国），采用电喷雾离子化（electrospray ionization, ESI）源。分离采用 Waters ACQUITY UPLC Cortecs T3 色谱柱（2.1×100 mm，1.6μm）及 Cortecs T3 保护柱（2.1×50 mm，1.6 μm）。MS 分析采用 ESI 源，采集范围为 50-1500 Da。每个样品进样 5μL，采用梯度洗脱，流动相为乙腈和 0.1% 甲酸水溶液，流速控制在 0.35 mL/min，柱温及自动进样器温度分别维持在 50°C 和 4°C。
Animals and Treatments
从上海模式生物研究中心购买 8 周龄雄性 Itgam-IRES-hCD89 小鼠 40 只（编号：NM-KI-200063），以同龄雄性 C57BL/6 小鼠 10 只作为对照组。小鼠在无特定病原体环境中饲养繁殖。所有实验均获得浙江中医药大学动物研究委员会批准（批准号：IACUC-20240311-07），并按照美国国立卫生研究院实验动物使用指南进行。
适应 1 周后，将 Itgam-IRES-hCD89 小鼠分为 IgAN 组、GQYS-L 组、GQYS-H 组和氯沙坦组，每组 10 只。GQYS-L 组和 GQYS-H 组分别通过灌胃给予 5.2 g/kg 和 10.4 g/kg 的 GQYS，其中 GQYS-L 组剂量相当于成人临床剂量（40 g / 天），GQYS-H 组为其两倍剂量。氯沙坦组给予 6.5 mg/kg 氯沙坦钾混悬液。这些剂量是根据临床使用剂量按体表面积换算得出。干预持续 5 个月。最后，处死所有小鼠，使用生化分析仪（Beckman Coulter，美国加利福尼亚州布雷亚）测定血清肌酐（Scr）、24 小时蛋白尿等生化指标，并收集肾脏用于进一步分析。
PAS Staining
肾脏组织在 10% 福尔马林溶液中浸泡过夜，随后包埋于石蜡中，切成 2 μm 厚的切片，进行 PAS 染色。通过玻片扫描系统（KF-PRO-020-HI；浙江康润生物信息科技有限公司）获取图像。
Network Pharmacology Analysis
Transcriptome Analyses
肾脏组织在液氮中快速研磨，按照制造商 protocol 使用 TRIzol 试剂提取总 RNA。使用 NanoDrop 2000 分光光度计（Thermo Scientific，美国）评估 RNA 纯度和定量，使用 Agilent 2100 生物分析仪（Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣克拉拉）评估 RNA 完整性。然后使用 VAHTS Universal V6 RNA-seq 文库制备试剂盒按照制造商说明构建文库。
RNA 测序由上海欧易生物科技有限公司完成。使用 FastQC（v0.11.9）对原始 fastq 文件进行初步质量控制，通过 HISAT2（2.1.0）将干净读数映射到参考基因组，使用 HTSeq-count（0.11.2）计算每个基因的 FPKM3 值和读数计数，使用 DESeq2（1.22.2）进行差异表达分析。以 Q 值 <0.05 且 log2 倍变化> 1.2 作为显著差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）的阈值。
数据分析通过 OECloud 工具（
https://cloud.oebiotech.com）完成，转录组原始数据已提交至 NCBI 的 GEO 数据库（GSE286126）。
Immunofluorescence Analysis
对 3 μm 冷冻肾脏切片用 Alexa Fluor?488 标记或 FITC 标记的山羊抗小鼠 IgA 和 C3 特异性抗体进行染色，通过共聚焦显微镜（STELLARIS 5，Leica，德国）拍摄图片，并由病理学家使用荧光显微镜（DM2000 LED，Leica，德国）双盲评分（n≥6）。
对于信号通路相关蛋白的检测，将 3 μm 石蜡切片与 TLR4、MyD88、磷酸化 NF-κB、IL-6、JAK2 和磷酸化 STAT3 等抗体孵育，采用 Alexa Fluor? Plus 488 标记的二抗，经 DAPI 核染色后，使用高内涵分析系统（Operetta CLS，PerkinElmer，英国）观察，并通过 ImageJ 软件分析（n=6）。
Western Blotting
肾脏蛋白在冷 RIPA 缓冲液中匀浆，随后通过 10% 或 15% SDS-PAGE 分离，转移至硝酸纤维素膜。孵育一抗和二抗后，通过 Odyssey 扫描仪（LI-COR Biosciences，美国内布拉斯加州林肯）检测蛋白条带，使用 ImageJ 软件（1.52p 版本）对条带进行定量分析（n=6）。
Statistical Analysis
使用 GraphPad Prism 软件（8.0.1 版本）进行数据分析，结果以均值 ± 标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，p<0.05 表示差异具有统计学意义。
Results
Component Analysis of GQYS
通过 UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析鉴定 GQYS 的化学成分，获得正离子和负离子模式下的总离子流色谱图。如表 S1 和 S2 所示，在 GQYS 中鉴定出 91 种成分。
GQYS Prevented Kidney Injury in Mice with IgAN
在整个实验过程中，各组小鼠的体重无显著变化，表明 GQYS 相对安全。与对照组相比，IgAN 小鼠的 24 小时蛋白尿、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）和天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase, AST）水平显著升高。与模型组相比，GQYS-L 组、GQYS-H 组和氯沙坦组的 24 小时蛋白尿和 ALT 水平明显降低，而各组的血清肌酐（Scr）水平无显著变化。PAS 染色显示，IgAN 小鼠的肾小球系膜细胞数量增加且系膜基质扩张，而 GQYS-L 组、GQYS-H 组和氯沙坦组的这些病理损伤显著减轻。这些结果表明 GQYS 具有肾脏保护作用。
GQYS Decreased IgA Deposition in the Mesangial Area of Mice with IgAN
如图 4 所示，IgAN 小鼠的肾小球系膜区存在显著的 IgA 颗粒状沉积。与模型组相比，GQYS-L 组、GQYS-H 组和氯沙坦组的 IgA 沉积显著减少。同样，在 IgAN 小鼠的肾小球系膜区观察到 C3 沉积，而干预组的 C3 沉积明显减少。这些结果表明 GQYS 可减少肾小球系膜区的 IgA 沉积。
Network Pharmacology of GQYS Active Compounds and Related Targets
从 TCMSP 数据库中获取五种草药（积雪草、黄芪、大黄、当归、桃仁）的 64 种活性化合物，经筛选后，每种草药分别鉴定出 3、20、16、23 和 2 种化合物。在 TCMSP 数据库中，15 种活性化合物未鉴定出相应靶点，去重后共分析 45 种独特的活性化合物（表 S3）。共鉴定出 214 个独特靶点，并构建 “草药 - 化合物 - 靶点” 网络以可视化它们之间的相互作用（图 S1），该网络由 268 个节点和 889 条边组成。度值最高的化合物为槲皮素（158）、山奈酚（58）、7-O - 甲基异鼠李素（42）和芒柄花素（35），表明这四种化合物可能是 GQYS 临床治疗疾病的关键成分。
从 GeneCards、OMIM 和 DisGeNET 数据库收集 IgAN 的疾病靶点，去重后共鉴定出 2756 个疾病靶点（表 S4）。通过取交集，鉴定出 138 个 GQYS-IgAN 共同靶点（图 5B 和表 S5）。随后构建了包含 138 个靶点的 PPI 网络，包含 133 个节点和 2428 条边（图 5C）。通过 KEGG 分析确定了参与 IgAN 治疗的主要信号通路，显著富集的通路包括 PI3K-AKT 信号通路、AGE-RAGE 信号通路、Toll 样受体（Toll-like receptor, TLR）信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）信号通路和核因子 -κB（nuclear factor-kappa B, NF-κB）信号通路（图 5D）。
Transcriptomics Analysis of Genes and Pathways Relevant to the Impact of GQYS on IgAN
IgAN 组与对照组之间最终检测到 267 个 DEGs，其中 196 个上调，71 个下调（图 6A，表 S6）。此外，GQYS 组与 IgAN 组之间有 503 个 DEGs，包括 171 个上调和 332 个下调基因（图 6B，表 S7）。其中，155 个基因在三组中均表现出相反方向的差异表达，通过热图分析进行可视化（图 6C、D）。基于 STRING 数据库建立的 PPI 网络包含 94 个节点和 2428 条边（图 6E）。KEGG 分析显示这些通路显著富集，包括细胞因子 - 细胞因子受体、JAK-STAT、TNF 和 NF-κB 信号通路（图 6F）。
GQYS Regulated TLR4/MyD88/NF-κB and IL-6/JAK2/STAT3 Signaling Pathways in Mice with IgAN
基于网络药理学和转录组学分析，对 TLR4/MyD88/NF-κB 和 IL-6/JAK2/STAT3 信号级联进行验证。IF 结果显示，TLR4 主要分布在肾小球中，而 MyD88、活化的 NF-κB、IL-6、JAK2 和活化的 STAT3 在肾小球和肾小管中均有表达。与模型组相比，GQYS 组的 TLR4、MyD88、活化的 NF-κB、IL-6、JAK2 和活化的 STAT3 表达显著降低。蛋白质印迹法结果显示，IgAN 小鼠中 TLR4、MyD88、活化的 NF-κB、IL-6、JAK2 和活化的 STAT3 的表达显著增加，而 GQYS 干预后其表达降低。这些结果表明 GQYS 可能调控 IgAN 小鼠的 TLR4/MyD88/NF-κB 和 IL-6/JAK2/STAT3 信号通路。
Discussion
本研究使用 Itgam-IRES-hCD89 小鼠，该小鼠与 Monteiro 等人开发的 CD89 转基因小鼠相似，其 CD89 表达由 CD11b 基因启动子驱动，在 20 周时自发出现大量系膜区 IgA 沉积、系膜基质扩张和轻度蛋白尿，能够反映 IgAN 的病理变化，因此被用于研究 GQYS 对系膜区 IgA 沉积和蛋白尿的影响。
中药因其多成分、多靶点的特性而具有复杂的多药理学特性。为更好地理解 GQYS 治疗 IgAN 的作用机制，本研究采用了两种互补策略：成分导向和通路导向。首先，通过质谱法鉴定 GQYS 的主要化学成分，随后利用网络药理学和 TCMSP 数据库，以口服生物利用度≥30% 和类药性≥1.8 为筛选标准，选择潜在活性化合物，并与质谱鉴定的成分进行交叉分析，发现山奈酚、芒柄花素和大黄酸三种共同成分。网络分析显示这三种化合物具有高度值，表明它们可能是 GQYS 治疗 IgAN 的关键活性成分。研究表明它们在调节炎症通路中发挥关键作用，例如山奈酚具有显著的抗炎作用，主要靶向 NF-κB 信号通路；大黄酸通过抑制 TLR4 信号通路保护 IgAN 肾病和 5/6 肾切除大鼠，还可通过抑制 STAT3 磷酸化、抑制肾小管细胞凋亡来减轻大鼠肾间质纤维化；芒柄花素通过靶向 JAK2/STAT3 信号通路保护大鼠免受脑缺血再灌注损伤相关的炎症。此外，本研究将网络药理学与转录组学相结合，准确鉴定出与 GQYS 治疗 IgAN 疗效相关的几个关键信号通路，包括 PI3K-AKT、AGE-RAGE、TLR、TNF、NF-κB、细胞因子 - 细胞因子受体相互作用和 JAK-STAT 信号通路。基于山奈酚、芒柄花素和大黄酸的现有证据，进一步聚焦并验证了 TLR4/MyD88/NF-κB 和 IL-6/JAK2/STAT3 信号通路。
Toll 样受体（TLRs）被认为是 innate 免疫反应和炎症的潜在介质。在包括 IgAN 在内的慢性肾脏疾病中，TLRs，特别是 TLR4 信号通路，通过促进炎症标志物的产生，在系膜细胞损伤和肾纤维化中起关键作用。Coppo 等人报道 IgAN 患者外周血单个核细胞中 TLR4 表达升高；He 等人报道 IgAN 大鼠中 TLR4 显著上调。TLR4 的经典信号通路之一是以髓系分化因子 88（myeloid differentiation factor 88, MyD88）依赖的方式激活 NF-κB，随后刺激 IL-6 和 MCP-1 的表达，这表明 TLR4 信号通路可能在缓解 IgAN 中具有治疗作用。在 Itgam-IRES-hCD89 小鼠中，TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路显著上调，而 GQYS 处理降低了这种上调，表明 GQYS 可能通过调节 TLR4/MyD88/NF-κB 介导的炎症来缓解 IgAN。
越来越多的证据表明 IL-6 在 IgAN 发病机制中起关键作用。先前的研究表明，IL-6 可导致人 IgA1 分泌细胞中异常糖基化 IgA1（Gd-IgA1）合成增加，在小鼠 IgAN 模型中也是如此。IgAN 中高表达的肾脏 IL-6 与 IgA 沉积程度和组织学损伤相关，此外，尿 IL-6 水平上调与 IgAN 进展密切相关。在 IL-6 激活的下游信号通路中，JAK/STAT 通路最为突出。在本 IgAN 模型中，观察到 IL-6/JAK2/STAT3 信号通路相关蛋白的表达显著增加，而 GQYS 处理降低了这种增加，这些结果表明 GQYS 可能通过抑制 IL-6 信号通路减轻 IgAN 小鼠的炎症并改善肾脏损伤。
本研究存在一些局限性：首先，缺乏相关信号通路抑制剂来进一步验证研究结果；其次，未进行肾细胞的体外实验；第三，目前尚无 GQYS 的随机临床试验数据，但研究团队正在积极开展相关工作。值得注意的是，已完成对 79 例 IgAN 患者的回顾性研究，显示 GQYS 显著降低血清肌酐并增加肾小球滤过率（未发表数据），希望未来能提供更多数据支持 GQYS 的临床疗效。
Conclusion
本研究通过网络药理学与转录组学相结合的方法探究了 GQYS 对 IgAN 的治疗作用。结果表明，GQYS 可能通过抑制 TLR4/MyD88/NF-κB 和 IL-6/JAK2/STAT3 信号通路发挥肾脏保护作用。预期本研究可为 GQYS 的中药新药开发提供理论依据，并为 IgAN 患者的治疗提供有前景的转化前景。
Abbreviations
GQYS，归芪益肾；IgAN，IgA 肾病；PAS，过碘酸 - 希夫；ESRD，终末期肾病；TCMSP，中药系统药理学数据库与分析平台；TLRs，Toll 样受体；MyD88，髓系分化因子 88；UPLC-Q-TOF-MS/MS，超高效液相色谱 - 四极杆飞行时间串联质谱；ESI，电喷雾离子化；PPI，蛋白质 - 蛋白质相互作用；ALT，丙氨酸转氨酶；AST，天冬氨酸转氨酶；IF，免疫荧光；GQYS-L，归芪益肾低剂量；GQYS-H，归芪益肾高剂量；TLR，Toll 样受体信号通路；TNF，肿瘤坏死因子；NF-κB，核因子 -κB；DEGs，差异表达基因；SD，标准差。
