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本研究揭示 miR-106a 和 miR-20a 在急性髓系白血病（AML）中高表达，与不良总生存期（OS）和无事件生存期（EFS）相关。联合检测可提升风险分层准确性，指导化疗与异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）选择，为 AML 预后评估和个体化治疗提供新依据。
摘要
背景：miR-106a 和 miR-20a（miR-17 家族成员）在 carcinogenesis 中常失调，但在急性髓系白血病（AML）中的预后意义尚不明确。
方法：采用 qRT-PCR 检测 115 例 AML 患者和 45 例健康对照者骨髓中 miR-106a 和 miR-20a 的表达，结合 TCGA 数据（n=188）分析其与临床因素和结局的关联，通过多种生物信息学方法进行相关分析。
结果：AML 患者中 miR-106a 和 miR-20a 表达高于健康对照。化疗组中，miR-106ahigh或 miR-20ahigh预示 OS 和 EFS 较差，双高表达结局最差；allo-HSCT 组中，两者高表达预示 OS 较差但 EFS 相似，双高表达 OS 最差。在高表达组，allo-HSCT 较化疗延长 OS 但不改善 EFS；低表达组中两种治疗的 OS 和 EFS 无明显差异。多变量分析证实其为独立预后标志物，且鉴定出 706 个相关差异表达基因（DEGs），涉及多种生物学过程和信号通路。
结论：miR-106a 和 miR-20a 是 AML 不良预后的潜在生物标志物，联合检测可改善风险分层并指导治疗选择（如高危患者行 allo-HSCT）。
通俗语言摘要
背景：急性髓系白血病（AML）是一种影响骨髓的血液肿瘤，尽管化疗和异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）有进展，但许多患者结局仍不佳。miR-106a 和 miR-20a 在 AML 中常过表达，但其对预后的预测作用尚不明确。
新发现：研究分析了 AML 患者与健康对照的骨髓中这两种 miRNA 的表达，结合 TCGA 数据评估其对总生存期（OS）和无事件生存期（EFS）的影响。结果显示 AML 患者中两者表达更高；化疗组高表达者 OS 和 EFS 更差，双高表达最差；allo-HSCT 组高表达者 OS 较差但 EFS 相似，双高表达 OS 最差。高表达者中，allo-HSCT 较化疗延长 OS 但 EFS 相似；低表达者中两种治疗的 OS 和 EFS 无明显差异。多变量分析证实其为独立预后预测因子，生物信息学分析显示两者影响 AML 进展相关的生物学过程和通路。
影响：该研究强调 miR-106a 和 miR-20a 作为 AML 预后生物标志物的重要性，其高表达与较差生存相关，联合检测可提高预后准确性，助力化疗与 allo-HSCT 的治疗选择。
引言
成人急性髓系白血病（AML）是一种复杂且异质性的疾病，特征是骨髓中未成熟髓系原始细胞积聚。它进一步以克隆进化为标志，白血病干细胞（LSCs）随时间积累额外突变，导致疾病进展和治疗耐药。 recurrent 染色体和遗传异常在 AML 的发生、进展、预后和风险分层中起关键作用，关键遗传改变包括 FLT3、NPM1、CEBPA、IDH1/2、TP53、KIT、EZH2 和 RAS 等。例如，FLT3-ITD 突变因增殖信号增强与不良预后相关，而 NPM1 突变在特定条件下与良好结局相关。此外，IDH1/2 突变产生致癌代谢物诱导表观遗传改变，TP53 突变导致基因组不稳定和治疗耐药。多种靶向疗法如 FLT3、IDH1 和 IDH2 抑制剂已成功用于 AML 治疗。尽管 AML 管理在风险评估、靶向药物和干细胞移植等方面有进展，但由于化疗耐药或复发，长期生存结局仍不理想。因此，迫切需要具有临床意义的新型预测因子来改善 AML 患者的风险分类和治疗决策，以提高临床结局。
微小 RNA（miRNAs）是一类丰富的非编码小 RNA，通过与靶 mRNA 的 3' 非翻译区特定基序相互作用调控基因表达，在多种生物学过程和肿瘤发生中起关键作用。一方面，miRNAs 在正常生理条件下通过调控造血干细胞功能和谱系分化来调节造血；另一方面，miRNAs 的异常与白血病的发生和维持有关。因此，一些失调的 miRNAs 已被证实可预测 AML 患者的预后，有望作为生物标志物完善当前的预后风险分层。例如，miR-124-1 高表达与较差结局相关，Han 等报道 miR-4262 过表达与不良临床预后相关，miR-155 上调的 AML 患者完全缓解（CR）率和总生存期（OS）较差。
miR-106a 和 miR-20a 属于高度保守的 miR-17 家族，通过其种子序列鉴定，该家族包括六个成熟成员：miR-17、miR-20a/b、miR-93、miR-106a/b。这些家族成员来源于重复和缺失事件，由三个不同的簇编码：miR-17～92（miR-17、miR-20a）、miR-106b～25（miR-106b、miR-93）和 miR-106a～363（miR-106a、miR-20b）。miR-17 家族成员在多种癌症中频繁扩增，但它们在 AML 中的临床相关性仍不明确，需要进一步研究。
TCGA 数据库中存在 188 例和 200 例 AML 患者的 miRNA 表达数据和临床数据。本研究利用 TCGA 数据库中 AML 患者的 miRNA 和临床数据，评估 miR-106a 和 miR-20a 在 AML 患者中的表达及其与临床因素、治疗方案和生存的关系，进一步探讨 miR-106a 和 miR-20a 联合分析在化疗和 allo-HSCT 组中的潜在预后价值。
材料与方法
RNA 提取、逆转录和实时定量 PCR
根据《赫尔辛基宣言》原则，所有参与者均获得书面知情同意。收集 115 例初诊 AML 患者的骨髓（BM）样本，另从非恶性血液病行骨髓穿刺患者中获取 45 例年龄匹配的健康对照样本。采用 Trizol（Thermo Fisher Scientific，USA）从 Ficoll 分离的骨髓单个核细胞中提取 RNA，按制造商 protocol 操作。采用 TaqMan MicroRNA Assay（Thermo Fisher Scientific，USA）测定 miR-20a 和 miR-106a 的表达水平。使用 TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（Thermo Fisher Scientific，USA）进行 cDNA 合成。采用 TaqMan PCR Master Mix 对 miR-20a 和 miR-106a 的表达进行定量，以 RNU6B 作为内参。采用 2?△△CT法计算 miR-20a 和 miR-106a 的相对表达水平。所有实验均进行三次重复。
数据获取与处理
188 例 AML 患者的 miRNA 表达数据和 200 例 AML 患者的临床数据来自 TGGA 数据库和原始文献。该研究经华盛顿大学人类研究委员会批准。为分析临床遗传特征与 miR-106a 或 miR-20a 表达的相关性，选择 173 例具有完整详细临床特征的初发 AML 患者。大多数患者接受 7 + 3 化疗方案（阿糖胞苷每日给药 7 天，伊达比星每日给药 3 天），其余主要接受去甲基化药物治疗。收集的临床数据包括性别、年龄、白细胞（WBC）计数、骨髓（BM）原始细胞、法美英（FAB）亚型、核型、风险等级、常见基因突变和随访时间。
生物信息学分析
采用 R studio 中的 Limma 包鉴定差异表达基因（DEGs），选择 | log2 倍变化（FC）| > 1 且调整后 P 值 < 0.05 的基因进行后续分析。通过 DAVID 利用 ClusterProfiler 进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。使用 ClusterProfiler 和 STRING 数据库构建基因集富集分析（GSEA）和蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络。
统计分析
采用 GraphPad Prism 8.0 和 SPSS 25.0 软件进行统计分析，双侧 P < 0.05 被认为具有统计学意义。以 miRNA 表达中位数将患者分为低或高 miRNA 表达组。分类变量采用 Pearson 卡方检验或 Fisher 精确检验，连续变量采用 Mann-Whitney U 检验。采用 Kaplan-Meier 曲线和 log-rank 检验评估 OS 和 EFS 分布。采用单变量和多变量 Cox 回归模型进行分析。
结果
miR-106a 和 miR-20a 在 AML 患者中的预后意义
研究首先分析了 AML 患者样本中 miR-106a 和 miR-20a 的表达水平，发现与健康个体相比，两种 miRNA 均显著上调。为验证和扩展研究结果，利用 TCGA 数据库中 188 例 AML 患者的 miRNA 表达数据进行全面的全基因组 miRNA 筛选。根据 miR-106a 和 miR-20a 表达中位数将患者分为高表达和低表达亚组。结果显示，miR-106ahigh患者的总生存期（OS）和无事件生存期（EFS）显著低于 miR-106alow患者；miR-20a 高表达也与 OS 和 EFS 降低相关。此外，Spearman 秩相关分析显示 miR-106a 和 miR-20a 表达呈强正相关（r = 0.481，P < 0.001）。进一步将患者分为三组：miR-106alow且 miR-20alow、miR-106ahigh或 miR-20ahigh、miR-106ahigh且 miR-20ahigh，三组间 OS 和 EFS 存在显著差异，其中 miR-106alow且 miR-20alow组患者的 EFS 和 OS 结局最佳。研究队列的分析也证实，miR-106a 高表达与 OS 显著降低相关，miR-20a 高表达亦是如此，且 miR-106a/miR-20a 联合检测可有效分层患者，miR-106alow且 miR-20alow组 OS 结局最有利。这些发现凸显了 miR-106a/miR-20a 联合检测作为 AML 稳健预后工具的潜在临床价值。
临床遗传特征与 miR-106a 或 miR-20a 表达的相关性
选择 173 例具有全面临床信息的患者，分为化疗组和异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）组，每组根据 miR-106a 或 miR-20a 表达中位数进一步分为两个亚组。化疗组中，与 miR-106alow患者相比，miR-106ahigh患者的中等核型病例比例更高（P = 0.005）、低危患者更少（P = 0.013）、M3 亚型患者更少（P = 0.012）、PML-RARα 发生率更低（P = 0.021）。miR-20a 高表达与 M1 亚型（P = 0.012）和 M2 亚型患者（P = 0.021）频率更高、复杂核型（P = 0.008）、高危（P = 0.016）和 FLT3 突变（P = 0.042）增加相关；而 miR-20a 低表达与更多低危患者（P = 0.042）、M3 亚型患者（P = 0.002）和 PML-RARα 患者（P = 0.004）相关。在 allo-HSCT 组中，与 miR-106alow患者相比，miR-106ahigh患者的 M4 亚型病例更少（P = 0.021），但复杂核型（P = 0.010）和高危（P = 0.002）发生率更高。值得注意的是，miR-20ahigh亚组患者的白细胞计数升高比例高于 miR-20alow亚组（P = 0.031）。其他临床遗传特征与 miR-106a 或 miR-20a 表达无显著关联。
miR-106a 和 miR-20a 在化疗或 allo-HSCT 患者中的预后意义
化疗组中，miR-106ahigh患者的总生存期（OS）和无事件生存期（EFS）显著低于 miR-106alow患者；miR-20ahigh患者的 OS 和 EFS 也短于 miR-20alow患者。对 miR-106a 和 miR-20a 表达的联合预后价值进一步分析显示，三组（双高、任一高、双低）间 OS 和 EFS 存在显著差异，其中 miR-106ahigh且 miR-20ahigh患者结局最差。在 allo-HSCT 组中，miR-106ahigh与 miR-106alow患者、miR-20ahigh与 miR-20alow患者间 OS 存在显著差异，但 EFS 无显著差异。对 miR-106a 和 miR-20a 进行联合分层分析，三组间 OS 再次存在显著差异，而 EFS 差异无统计学意义，其中 miR-106ahigh且 miR-20ahigh患者 OS 结局最差。这些发现表明，miR-106a 和 miR-20a 高表达可特异性预测接受化疗或 allo-HSCT 的 AML 患者的不良预后。
Allo-HSCT 部分减轻 miR-106a 和 miR-20a 高表达对 OS 的影响
为研究 allo-HSCT 能否改善 miR-106a 和 miR-20a 高表达相关的不良预后，将 173 例患者根据 miR-106a 或 miR-20a 表达中位数分为两组，每组再分为接受化疗或 allo-HSCT 的亚组。miR-106ahigh组中，接受 allo-HSCT 的患者 OS 延长（24.8 个月 vs 8.0 个月，P = 0.002），EFS 相似（P = 0.108）；而 miR-106alow组中，化疗与 allo-HSCT 组的 OS 和 EFS 无显著差异。同样，miR-20ahigh患者中，allo-HSCT 亚组 OS 优于化疗亚组（26.3 个月 vs 5.7 个月，P = 0.010），EFS 相似（P = 0.177）；miR-20alow患者中，两组 OS 和 EFS 也无差异。这些发现表明，miR-106a 和 miR-20a 高表达的 AML 患者可能从 allo-HSCT 干预中获益。
miR-106a/miR-20a 联合检测在 AML 中的独立预后价值
整个队列的单变量分析显示，miR-106a/miR-20a 联合检测是 EFS 和 OS 的不良预后指标。接受 allo-HSCT 的患者 OS 改善（P = 0.004），而 DNMT3A 突变与 EFS 和 OS 缩短相关（P 分别为 0.019 和 0.013）。多变量分析证实，即使调整白细胞计数、治疗方案以及 DNMT3A、RUNX1 和 KRAS/NRAS 突变状态等混杂因素后，miR-106a/miR-20a 联合检测仍是 EFS（P = 0.005）和 OS（P = 0.002）的独立预测因子。研究队列的单变量和多变量 Cox 回归分析也证实 miR-106a/miR-20a 联合检测可独立预测 OS。化疗亚组中，单变量分析显示 miR-106a 和 miR-20a 高表达对 EFS 和 OS 有不良影响，DNMT3A 突变导致 EFS 和 OS 不良，RUNX1 突变对 OS 有不良影响（P = 0.045）；多变量分析证实，即使考虑 DNMT3A、RUNX1 和 ASXL1 突变状态，miR-106a 和 miR-20a 同时高表达仍是 EFS（P = 0.015）和 OS（P = 0.036）的独立危险因素。allo-HSCT 亚组中，单变量分析显示 miR-106a/miR-20a 联合检测与较差 OS 相关（P = 0.019），但与 EFS 无关（P = 0.282）；PHF6 突变与较差 EFS 和 OS 相关（P 分别为 0.013 和 0.020）；多变量分析证实 miR-106a/miR-20a 联合检测是不良 OS 的独立预测因子（P = 0.043），但与 EFS 无关（P = 0.471）。这些证据凸显了 miR-106a/miR-20a 联合检测在不同治疗亚组 AML 中的稳健预后价值。
AML 中 miR-106a/miR-20a 表达谱的生物学分析
火山图显示，在 miR-106a/miR-20a 双高表达组与双低表达组之间共鉴定出 706 个差异表达基因（DEGs），包括 231 个上调基因和 475 个下调基因。在下调的 DEGs 中，通过 Targetscan、miRWalk 和 miRanda 预测，16 个基因为 miR-106a 和 miR-20a 的共同靶基因，包括 ANTXR1、ATP2B2、FBLIM1、FLT1、ITIH5、LILRB1、MRAS、PCSK5、S1PR3、SHROOM1、SLC2A3、SMOC2、SSTR2、TENM4、TLR7 和 TNFAIP8L3。分析这 16 个基因的表达发现，与正常对照相比，AML 患者中 ANTXR1、FLT1、MRAS、ITIH5、SHROOM1、SLC2A3 和 SMOC2 显著下调。GO 和 KEGG 分析显示，DEGs 在生物学过程（BP）层面显著富集于通过质膜黏附分子的细胞间黏附、细胞间连接组织、通过质膜黏附分子的同源细胞黏附和突触修剪等；在细胞组分（CC）层面富集于含胶原的细胞外基质、细胞间连接、突触膜和胶原三聚体等。KEGG 通路分析显示 miR-106a/miR-20a 联合检测涉及蛋白质消化吸收、补体和凝血级联反应等过程。此外，GSEA 分析显示双高与双低表达组在基质体、ECM 受体相互作用、细胞外基质组织、A 类受体清除、PI3K-akt 信号通路、胶原、细胞外基质降解、囊泡介导的运输、清道夫受体对配体的结合和摄取、胶原生物合成和修饰酶、先天免疫系统等通路存在显著差异。利用 STRING 数据库构建 DEGs 的 PPI 网络，鉴定出 15 个分子复合物检测（MCODE）模块。这些生物信息学分析强调 miR-106a 和 miR-20a 参与调控多种生物学过程和信号通路，进一步证实了它们在 AML 中的临床价值。
讨论
本研究证实 miR-106a 和 miR-20a 在 AML 中具有显著的预后意义，强调它们作为独立预后因素的潜力，并为 AML 患者的临床决策提供指导。miR-106ahigh和 miR-20ahigh患者生存不良，可能更适合 allo-HSCT 而非单纯化疗。此外，miR-106a/miR-20a 的基因表达谱涉及多种生物学功能和信号通路。
选择 miR-106a 和 miR-20a 进行研究是因为尽管核苷酸组成不同，但它们具有相同的 AAAGUGC 种子序列，这提示它们可能具有重叠功能。例如，在结肠癌中，miR-106a 和 miR-20a 常上调，通过介导 WTX 缺失发挥癌基因作用，促进癌症进展和肝转移；在肺鳞状细胞癌中，它们被确定为诊断标志物组的成员；在淋巴瘤中，miR-106a 和 miR-20a 的血浆水平与较高死亡率相关。此外，miR-106a 和 miR-20a 在造血中具有相似功能，在髓系祖细胞中大量表达，通过干扰 SQSTM1 调控的通路促进造血细胞扩增，而在成熟中性粒细胞、单核细胞和巨核细胞中表达降低。鉴于它们与髓系分化的关联，miR-106a 和 miR-20a 在 AML 中发挥作用并不令人意外。先前研究已证实它们在 AML 样本中过表达，本研究结果进一步证实了这一点，即 miR-106a 和 miR-20a 高表达与 OS 和 EFS 降低相关，且双高表达患者预后最差，表明该联合检测可有效预测临床结局。Spearman 秩相关分析显示 miR-106a 和 miR-20a 表达呈正相关，提示它们在 AML 发病机制中可能具有协同作用，值得进一步探索它们的复杂相互作用。研究探索临床遗传特征与 miR-106a/miR-20a 表达的相关性
