RAG重组酶表达揭示自然杀伤细胞发育新机制：从V(D)J重排到终末分化

这篇研究通过构建RAG命运示踪报告系统的人iPSC模型，揭示了重组激活基因（RAG）介导的V(D)J重排事件在自然杀伤（NK）细胞发育中的关键作用。研究发现14%的成熟NK细胞（CD45dimCD56dimCD57+）具有RAG表达史，其携带IGH位点非功能性重排，呈现终末分化表型但伴随DNA损伤应答（DDR）能力缺陷。该工作为理解NK细胞异质性提供了新视角。

　　

RAG重组酶表达区分自然杀伤细胞发育

引言
传统观点认为V(D)J重组是T/B淋巴细胞抗原受体多样化的专属机制，而缺乏克隆型受体的自然杀伤（NK）细胞无需此过程。然而新证据表明，4%-40%的人和小鼠NK细胞实际源自RAG表达祖细胞，其免疫球蛋白（Ig）和T细胞受体（TCR）位点存在非功能性重排。为探究重排事件对NK细胞成熟的影响，研究团队利用CRISPR/Cas9技术在AAVS1位点插入RSS-invEGFP报告系统，构建了RAG命运示踪的人诱导多能干细胞（iPSC）系，并通过体外分化获得NK细胞。

方法
实验采用新生儿包皮成纤维细胞来源的iPSC，在OP9-DL1基质细胞上分化为造血干细胞祖细胞（HSPC）和NK细胞。通过流式细胞术每周监测GFP表达及CD45^bright/CD45^dim、CD56^bright/CD56^dim等表面标志。功能实验包括与K562/P815细胞共培养评估脱颗粒（CD107a）、细胞毒性（穿孔素、颗粒酶B）和干扰素γ（IFNγ）分泌，以及2Gy电离辐射后的DDR（γH2AX焦点）和存活分析。IGH位点重排通过多重PCR和NGS测序解析，转录组采用RNA-Seq检测。

结果
RAG重组酶主要在CD45^dim NK祖细胞中表达
双等位基因报告系统（RSS-EGFP^+/+）显示，高达14%的成熟NK细胞存在GFP表达，且90%的CD45^dim群体为GFP⁺，而CD45^bright群体主要呈GFP^?。CD45异构体分析揭示GFP⁺细胞偏好表达CD45RO/RB，而GFP^?细胞以CD45RA为主。转染额外RAG1/RAG2 mRNA可使GFP⁺比例提升至21.4%，证实报告系统的有效性。

RAG命运示踪NK细胞呈现高成熟度表型
GFP⁺CD56^dim细胞显著高表达终末分化标志CD57、激活受体DNAM1和NKp44，以及适应性NK细胞特征分子NKG2C^+/?和KIR^+/?。功能上，该群体脱颗粒能力（CD107a⁺率）和IFNγ分泌显著增强，但ADCC活性无差异。转录组分析显示，GFP⁺细胞高表达细胞毒相关基因（GZMA/B、TNFSF10）和ITAM信号分子（TYROPB、FCER1G），而代谢调节基因（如mTOR通路成员LAMTOR2）亦显著上调。

基因组重排与DDR缺陷
NGS分析证实GFP⁺细胞存在IGH位点非功能性重排，表现为假基因使用、阅读框破坏和高克隆性。值得注意的是，该群体在电离辐射后呈现持续性γH2AX信号和存活率下降，提示DDR通路受损。

讨论
本研究首次在人类模型中证实RAG表达可区分NK细胞发育轨迹。CD45^dimRO⁺RB⁺表型暗示这群细胞可能具有记忆样特性，而高细胞毒性伴随DDR缺陷则反映其终末分化状态。尽管IGH重排均为非功能性，但其对NK细胞成熟的调控作用可能通过表观遗传重塑实现。该发现为理解NK细胞在免疫监视、肿瘤微环境适应中的功能异质性提供了新机制视角。