心血管组织光学透明化技术优化：基于二次谐波与多光子成像的猪左前降支动脉研究

这篇综述系统评估了BABB（苯甲醇苯甲酸酯）和甘油（GLY）两种光学透明化剂对猪左前降支动脉（LADA）的二次谐波（SHG）和多光子显微镜（MPM）成像效果的影响，揭示了BABB在提升组织透明度（SHG-AUC提升24倍）、信号深度穿透（zmax全层可视）及长期保存（14天无衰减）中的显著优势，为心血管3D显微成像提供了标准化方案。

　　

引言

近年来，非侵入性成像技术如多光子显微镜（MPM）和二次谐波（SHG）在生物医学领域崭露头角。MPM通过双光子激发荧光（TPF）捕获内源性荧光团（如FAD和NADH），实现亚细胞分辨率；SHG则利用胶原等非中心对称结构产生无标记成像信号。然而，心血管组织因高脂含量和复杂结构导致光散射严重，传统方法难以实现深层成像。本研究以猪左前降支动脉（LADA）为模型，探索光学透明化技术对成像质量的优化策略。

材料与方法

实验设计分为三部分：

1. Study 1：对比BABB与甘油（GLY）在固定/未固定条件下的效果，共6组（BABB、BABB-F、GLY、GLY-F、NC、NC-F）；
2. Study 2：分析福尔马林固定时长（0-240分钟）对BABB透明化的影响；
3. Study 3：评估BABB长期保存（0-14天）的信号稳定性。

组织处理采用梯度乙醇脱水（50%-100%）后，分别用BABB（苯甲醇:苯甲酸酯=1:2）或甘油透明化。成像使用Leica SP8系统，830 nm激发波长检测AF（500-550 nm）和SHG（410-420 nm）信号，通过ImageJ和MATLAB分析z-stack强度曲线及曲线下面积（AUC）。

结果

1. 透明化剂对比：BABB组AF-AUC（0.1205±0.0168）和SHG-AUC（0.0072±0.0040）显著高于GLY组（p<0.001），且信号可穿透全层（z/z_max≈1）。固定后，BABB-F的AF信号降低，而GLY-F反升，提示固定与透明化剂的协同效应。
2. 固定时长：120分钟固定导致AF-AUC异常降低（0.0608±0.0244 vs. 0.1496±0.0290，p<0.05），可能与蛋白质交联暂时遮蔽荧光团有关。
3. 长期保存：BABB中存储14天未引起信号衰减（AF-AUC波动<10%），证实其稳定性。

讨论

BABB的优异性能源于其高折射率（RI≈1.55）与脂质清除能力，可匹配弹性蛋白（RI≈1.51）并减少散射。相比之下，甘油（RI≈1.44）因无法去除脂质且粘度高，效果受限。值得注意的是，福尔马林固定对SHG信号无显著影响，但可能通过羟基甲基桥交联干扰AF信号。

局限与展望

未来需扩展至全血管成像，并探索尿素基透明化（如Scale）的适用性。此外，120分钟固定的信号骤降机制需分子层面验证。

结论

BABB是心血管组织深层MPM/SHG成像的理想透明化剂，其快速（<4小时）、深度穿透及长期稳定的特性为心血管病理研究提供了新工具。