土茯苓靶向抑制幽门螺杆菌分泌脲酶的成分表征及机制研究

本研究揭示了土茯苓(Smilax glabra Roxb., SGR)通过靶向抑制幽门螺杆菌(H. pylori)分泌脲酶(HPU)发挥抗菌作用的分子机制。采用UPLC-ESI-MS/MS鉴定出34种活性成分，其中黄酮类化合物astilbin对HPU的抑制强度达IC50 1.04 mg/mL。酶动力学证实SGR通过非竞争性抑制HPU和混合型抑制JBU（jack bean urease），其作用靶点为脲酶活性中心的巯基(-SH)。分子对接显示astilbin与HPU活性位点ARG338等关键氨基酸形成氢键，为开发新型抗H. pylori天然药物提供理论依据。

　　

1 引言

幽门螺杆菌(H. pylori)作为I类致癌原，其分泌的镍依赖型脲酶(HPU)通过水解尿素产氨破坏胃黏膜，导致胃炎、溃疡甚至胃癌。土茯苓(SGR)作为药食两用植物，传统用于胃肠疾病治疗，但其抗H. pylori机制尚不明确。本研究首次系统解析SGR通过靶向HPU活性中心的分子机制，为天然抗菌剂开发提供新思路。

2 材料与方法

采用70%乙醇热回流提取SGR活性成分，UPLC-ESI-MS/MS鉴定出astilbin等34种化合物。通过琼脂稀释法测定对H. pylori标准菌株(ATCC 43504等)的最小抑菌浓度(MIC)，改良Berthelot法检测HPU和JBU抑制活性。Lineweaver-Burk双倒数作图分析抑制类型，硫醇试剂(DTT/GSH)和镍离子螯合剂(硼酸/氟化钠)探究作用靶点，AutoDock Vina进行astilbin与脲酶(PDB 1E9Y/3LA4)的分子对接。

3 结果

3.1 成分鉴定
质谱分析揭示SGR主要含黄酮苷类成分，包括astilbin(m/z 451.1)、neoastilbin(m/z 435.1)等，其化学结构中C-3位羟基与糖苷键可能为关键药效团。

3.2 抗菌活性
SGR对H. pylori临床株ICDC 111001的MIC为0.5 mg/mL，显著优于标准株ATCC 43504(1.5 mg/mL)，提示菌株敏感性差异。

3.3 脲酶抑制
SGR对HPU和JBU的IC₅₀分别为1.04±0.01 mg/mL和1.01±0.01 mg/mL。动力学分析显示：

• HPU：非竞争性抑制，K_i=0.10±0.01 mg/mL，V_max降低而K_M不变
• JBU：混合型抑制，K_i=0.02±0.02 mg/mL，K_is=0.61±0.08 mg/mL

3.4 作用机制
硫醇试剂GSH使抑制后的HPU活性恢复40%，而镍离子螯合剂无此效应，证实SGR主要靶向脲酶活性中心的半胱氨酸残基(-SH)。分子对接显示astilbin与HPU的MET317、HIS138形成氢键(结合能-8.0 kcal/mol)，稳定"flap"区域开放构象。

3.5 关键成分
Astilbin抑制HPU的IC₅₀(1.47±0.01 mM)显著优于engeletin(5.89±0.01 mM)，其3-OH和4-C=O可能为关键结合位点。

4 讨论

SGR通过黄酮苷类成分靶向HPU活性中心的巯基，区别于临床常用镍离子螯合剂(如乙酰氧肟酸AHA)。Astilbin的2,3-二羟基黄酮骨架与HPU移动 flap 区ARG338的氢键网络，为首次揭示的天然产物特异性结合模式。值得注意的是，SGR对JBU的混合型抑制提示其可能通过别构效应影响脲酶四聚体构象，这为开发广谱脲酶抑制剂提供新策略。

5 结论

本研究阐明SGR通过astilbin等成分靶向HPU活性中心巯基，以非竞争性方式抑制脲酶活性。该发现不仅解析了传统中药抗H. pylori的物质基础，更为设计新型胃肠疾病治疗药物提供分子模板。未来可优化astilbin衍生物以提高其口服生物利用度。