产气荚膜梭菌二元毒素BECb(CPILEb)孔道中丝氨酸钳的关键作用：细胞毒性与肠毒性的分子机制解析

本研究针对产气荚膜梭菌二元毒素BECb独特的肠毒性机制，通过冷冻电镜和电生理技术揭示其孔道中丝氨酸钳(s-clamp)替代传统苯丙氨酸钳(φ-clamp)的结构特征，发现该变异使孔道直径扩大至12.9?并增强离子通透性，阐明了BECb不依赖A组分即可引发细胞毒性和肠道病变的分子基础。该成果为理解细菌毒素致病机制提供了新视角，发表于《Communications Biology》。

　　

产气荚膜梭菌是引发人类食物中毒的重要病原体，其致病性主要由分泌的毒素决定。传统认知中，这类细菌的二元毒素需要A、B两组分协同作用才能产生毒性，但近年来在日本食物中毒事件中分离的菌株却表现出独特特征——其产生的二元毒素BEC（又称CPILE）中，B组分BECb单独即可引发肠道病变。这一反常现象背后的分子机制成为亟待解决的科学问题。

东京都公共卫生研究所（Tokyo Metropolitan Institute of Public Health）的研究团队在《Communications Biology》发表的研究，通过结构生物学与功能实验相结合的方法，揭示了BECb孔道中丝氨酸残基形成的"丝氨酸钳"(s-clamp)替代传统二元毒素中苯丙氨酸钳(φ-clamp)的特殊结构，阐明了这种变异如何赋予BECb独立致病能力的分子机制。研究发现，s-clamp不仅使孔道直径扩大至12.9?（相比φ-clamp的6?），还通过增强离子通透性导致细胞膜稳态破坏，这为理解细菌毒素的致病多样性提供了新视角。

研究人员采用冷冻电镜解析了Ib(F454S)突变体（模拟BECb的s-clamp结构）的孔道结构（分辨率2.36?），通过AlphaFold 3预测BECb孔道模型，并利用平面脂双层电生理记录比较野生型与突变体的离子传导特性。细胞实验采用MDCK、A431和L929细胞系评估毒性，兔肠袢试验检测肠毒性，Western blot分析寡聚体形成。分子动力学模拟辅助验证孔道特性差异。

丝氨酸钳结构的发现与表征
通过序列比对发现BECb孔道最窄处由丝氨酸残基（Ser405）构成，而非其他二元毒素保守的苯丙氨酸。冷冻电镜显示Ib(F454S)突变体的s-clamp直径达10.4?，比野生型φ-clamp扩大73%。AlphaFold预测BECb孔道的s-clamp直径更达12.9?，内部呈现负静电势。

s-clamp决定细胞毒性
实验显示野生型BECb单独即可诱导MDCK细胞死亡（24小时1μg/ml存活率<20%），而将s-clamp突变为φ-clamp（S405F）后毒性显著降低。相反，将Ib的φ-clamp突变为s-clamp（F454S）则使原本无毒的Ib获得细胞毒性。电生理测量显示s-clamp使单通道电导提升9倍（从67pS增至620pS），计算孔径从0.30nm增至0.94nm。

孔道阻断剂的保护效应
带正电荷的β-环糊精衍生物AMBnTβCD能有效阻断BECb孔道，完全预防细胞毒性，证实孔道形成是毒性关键。而带负电荷的HSβCD无保护作用，验证了孔道内部的负电性特征。

肠毒性动物模型验证
兔肠袢实验显示50μg BECb即引发严重肠液积聚（FA比值0.96）和出血性病变，而s-clamp突变体（S405F）即使剂量加倍（100μg）毒性也显著减弱（FA比值0.14）。组织学观察显示野生型BECb导致绒毛萎缩、水肿和血管扩张等典型肠毒素损伤。

分子机制阐释
研究提出BECb通过s-clamp形成更大孔径的孔道，增强离子流动破坏细胞膜电位，同时保留转运A组分BECa的能力。这种"一箭双雕"的特性使其既能作为孔道毒素直接致病，又能作为转运通道增强二元毒素的整体毒性。

该研究首次阐明二元毒素B组分独立致病的结构基础，突破了对二元毒素协同作用模式的传统认知。发现的s-clamp结构特征为产气荚膜梭菌食物中毒的精准诊断提供了分子标记，AMBnTβCD的阻断效应则为治疗策略开发指明方向。研究还建立了孔道尺寸与毒性程度的定量关系，为理解孔道毒素的致病谱差异提供了新框架。这些发现不仅推动细菌毒素研究进入更精细的结构-功能分析阶段，也为相关食物中毒的防治提供了理论依据。