假单胞菌衣康酸降解基因簇编码甲基琥珀酸利用酶揭示土壤微生物代谢新机制

本研究揭示了假单胞菌衣康酸降解基因簇的双重功能：除降解免疫调节剂衣康酸(Itaconate)外，该簇还编码甲基琥珀酸(甲基琥珀酸)代谢的关键酶——(S)-(R)-甲基琥珀酸异构酶和(RS)-甲基琥珀酰-C4-CoA脱氢酶。通过异源表达和生化实验，研究人员证实这些酶可协同转化甲基琥珀酸立体异构体为乙酰辅酶A，其广泛存在于1.6%的已测序原核生物（主要为β-变形菌）中。该发现为理解土壤微生物碳代谢网络及病原体抗真菌机制提供了新视角。

　　

在微生物代谢的复杂网络中，C₅支链二羧酸（如衣康酸、甲基琥珀酸）扮演着双重角色：既是关键代谢中间体，又是真菌产生的抗菌物质。衣康酸作为巨噬细胞免疫调节的核心分子，其降解机制在病原体（如耶尔森菌）中已有研究，但土壤细菌中相关基因簇的进化意义仍是未解之谜。更引人深思的是，这些基因簇中总伴随两个"神秘基因"——预测的酰基辅酶A脱氢酶和MmgE/PrpD家族蛋白，其功能长期悬而未决。

德国明斯特大学的研究团队在《Communications Biology》发表的研究解开了这个谜题。通过系统分析 Cupriavidus necator 和 Pseudomonas aeruginosa 的代谢通路，发现这些"神秘基因"实为甲基琥珀酸代谢的关键酶：(S)-(R)-甲基琥珀酸异构酶和(RS)-甲基琥珀酰-C₄-CoA脱氢酶。这一发现不仅揭示了土壤微生物降解甲基琥珀酸的完整路径，更暗示这种化合物在自然环境中可能比预想的更为丰富。

研究采用多组学联用策略：通过比较蛋白质组学分析不同碳源培养下细菌的酶表达谱；利用异源表达系统纯化关键酶并进行动力学表征；结合UHPLC监测CoA酯中间体；建立隐马尔可夫模型(HMM)分析酶在微生物界的分布规律。

甲基琥珀酸代谢通路的解析
生长实验显示C. necator能利用(R)-和(S)-甲基琥珀酸，但前者效率更高。通过细胞提取物分析，研究人员捕捉到甲基琥珀酰-CoA中间体，并发现其转化活性在甲基琥珀酸培养条件下显著提升。异源表达的衣康酸CoA转移酶（Ict）对(R)-甲基琥珀酸的催化效率(k_cat/K_M=65.2 s^-1mM^-1)远超(S)-异构体(0.7 s^-1mM^-1)，这种立体选择性在Pa. xenovorans和P. aeruginosa中高度保守。

双功能异构酶的发现
研究首次证实MmgE/PrpD家族蛋白具有(S)-(R)-甲基琥珀酸异构酶活性（比活72.3 μmol/min/mg）。该酶通过形成烯醇中间体实现立体异构转化，其保守的His102-Tyr148-Kys266催化三联体与iminodisuccinate差向异构酶相似。值得注意的是，该酶仅作用于游离羧酸而非CoA酯，完美适配Ict的底物偏好性。

脱氢酶的底物特异性
纯化的酰基-CoA脱氢酶被鉴定为(RS)-甲基琥珀酰-C₄-CoA脱氢酶，能以FAD为辅基催化生成mesaconyl-C₄-CoA（k_cat/K_M=1.5 s^-1mM^-1）。UHPLC分析证实其产物与化学合成的mesaconyl-C₄-CoA标准品完全一致，而Ict特异性生成C₄-CoA酯的特性避免了代谢"死胡同"的产生。

生态与进化意义
基因组分析揭示1.6%的原核生物（主要为Betaproteobacteria）拥有完整甲基琥珀酸利用基因簇。值得注意的是，病原体（如耶尔森菌）的衣康酸降解簇仅含三个核心基因，而土壤细菌的扩展簇包含五个基因，提示甲基琥珀酸在土壤生态中的重要性。近期研究发现人类肠道菌Eggerthella lenta能将衣康酸还原为甲基琥珀酸，这为理解自然环境中的甲基琥珀酸来源提供了新线索。

这项研究重塑了人们对微生物C₅二羧酸代谢的认知：衣康酸降解簇实为"代谢瑞士军刀"，既能解毒真菌抗菌剂，又能利用其还原产物甲基琥珀酸。从应用角度看，(RS)-甲基琥珀酰-C₄-CoA脱氢酶的发现为合成生物学提供了新工具，可衔接乙基丙二酰辅酶A途径与三羧酸循环。而甲基琥珀酸异构酶催化机制的解析，则为理解MmgE/PrpD超家族酶的进化提供了关键线索。这些发现对开发新型抗感染策略和设计合成代谢通路具有重要指导价值。