利用早熟艾美耳球虫转基因表达RHDV P2亚域诱导兔体免疫应答的双价疫苗研发

本研究针对兔球虫病和兔出血症(RHD)对养兔业造成的重大经济损失，创新性地利用早熟型Eimeria magna(EmagPWT)作为疫苗载体，成功构建了表达RHDV1和RHDV2衣壳蛋白VP60 P2亚域的三种转基因寄生虫。研究发现二次免疫后可诱导产生中和抗体和显著黏膜免疫反应，为开发同时预防Eimeria和RHDV感染的双价口服疫苗提供了新策略，具有重要临床应用价值。

　　

在养兔业蓬勃发展的今天，兔出血症(RHD)和球虫病如同两把悬在养殖户头上的达摩克利斯之剑。RHDV1和RHDV2两种病毒变体肆虐兔群，前者自1984年在中国首次爆发，后者2010年现身法国后迅速蔓延至全球，2020年传入中国后展现出更强大的致病力——能感染幼兔且宿主范围更广。与此同时，由艾美耳球虫(Eimeria spp.)引起的球虫病导致腹泻、消瘦甚至死亡，现有抗球虫药物却面临耐药性和药物残留的双重困境。这两种疾病每年给养兔业造成数以亿计的经济损失，亟需开发新型防控手段。

中国农业大学的研究团队独辟蹊径，将目光投向了一种特殊的生物载体——早熟型Eimeria magna(EmagPWT)。这种经过人工选育的球虫株系具有生命周期短、致病性低但保持良好免疫原性的特点，是理想的活疫苗候选者。研究人员创新性地将其改造为"生物导弹"，携带兔出血症病毒的关键抗原成分，相关成果发表在《npj Vaccines》上。

研究团队主要运用了四项关键技术：通过限制酶介导的转染技术将P2基因导入球虫基因组；利用荧光激活细胞分选(FACS)和乙胺嘧啶筛选获得稳定转染株；采用Western blot和间接免疫荧光(IFA)验证外源蛋白表达；通过血凝抑制(HI)试验和流式细胞术评估免疫效果。实验动物采用35日龄无球虫感染的家兔，所有操作均遵循动物伦理规范。

【Construction and Identification of transgenic parasites expressing P2 subdomain from RHDV1 or/and RHDV2 in precocious Eimeria magna】
研究成功构建了三种转基因寄生虫：EmagP-VP60P2(1)、EmagP-VP60P2(2)和EmagP-VP60P2(1+2)，分别表达RHDV1、RHDV2以及两者的P2亚域。Western blot检测到约22kDa(单P2)和45kDa(双P2)的特异性条带，免疫荧光显示P2蛋白主要定位于子孢子的细胞质中。基因组PCR证实外源基因成功整合，荧光标记率最高达95%。

【Transgenic parasites have similar biological characteristics of EmagPWT】
生物学特性分析显示，转基因株与亲本株EmagPWT具有相似的繁殖力：接种500个卵囊后，均在4天开始排卵，6天达峰。用1×10⁴个野毒株卵囊攻击后，免疫组卵囊排出量显著低于未免疫组，体重增长也明显优于攻毒对照组，证实转基因株保持了良好的免疫保护性。

【Transgenic parasites elicit excellent antibody response against EmagPWT and detectable RDHV-specific humoral immune responses in rabbits】
免疫实验采用初免-加强策略，3×10³个卵囊初免后，用1×10⁴个卵囊加强。结果显示：所有球虫免疫组均产生高水平的抗Eimeria IgG；针对RHDV1-P2的IgG在EmagP-VP60P2(1)和(1+2)组显著升高；HI试验显示部分兔血清对RHDV1和RHDV2产生中和活性，虽低于商业疫苗组，但显著优于对照组。

【Eimeria parasites can stimulate higher cellular immune response】
流式分析发现球虫免疫组肠系膜淋巴结(MLN)中CD8⁺T细胞比例显著升高(7.51% vs 4.76%)，CD4⁺T细胞比例保持稳定(27-40%)。回肠组织切片显示CD4⁺和CD8⁺T细胞浸润，表明转基因球虫能有效激发局部黏膜免疫应答。

这项研究开创性地证实了转基因早熟球虫作为多价疫苗载体的可行性。虽然目前诱导的RHDV特异性抗体水平尚不及传统疫苗，但其独特的口服给药方式和双重保护潜力具有重要价值。研究揭示了几个关键发现：P2亚域作为RHDV的关键抗原表位，其表达不影响载体球虫的生物学特性；二次免疫策略能显著提升免疫效果；球虫感染主要激活CD8⁺T细胞介导的免疫应答。

从转化医学角度看，这项技术为开发新型口服多价疫苗提供了全新思路。未来通过优化抗原表达水平、引入分子佐剂（如细胞因子）或靶向分泌信号肽，有望进一步提升免疫效果。这种"一箭双雕"的疫苗策略不仅可降低养殖成本，还能减少免疫应激，对推动养兔业可持续发展具有重要意义。正如作者指出，这项研究为同时防控兔球虫病和出血症提供了概念验证，虽然距离实际应用还有距离，但无疑开辟了一条值得深入探索的新途径。