祖先序列重建技术解析模块化聚酮合酶结构机制

本研究针对模块化聚酮合酶(PKS)结构解析难题，创新性地将祖先序列重建(ASR)技术应用于GfsA加载模块的酰基转移酶(ATL)结构改造，成功获得高分辨率晶体结构(2.0?)和冷冻电镜结构(2.7?)，揭示了KSQ-ACP相互作用的多态性特征，为复杂多域蛋白结构研究提供了新范式。

　　

模块化聚酮合酶(PKS)是自然界合成抗生素、抗癌药物等重要次级代谢产物的分子工厂，其复杂的多域结构如同精密的装配流水线。然而，这些巨型酶机器的动态构象变化使得高分辨率结构解析成为长期困扰学界的难题，严重制约了对其催化机制的深入理解和理性改造。传统结构生物学手段在解析全长PKS模块时往往遭遇结晶困难或构象异质性等问题，即便是近年来快速发展的冷冻电镜技术也常因蛋白聚集而束手无策。

日本东京大学（The University of Tokyo）Taichi Chisuga领衔的研究团队独辟蹊径，将新兴的祖先序列重建(ASR)技术引入PKS结构研究。他们以链霉菌来源的FD-891聚酮合酶加载模块为模型，该模块包含酮合酶样脱羧酶(KS_Q)、酰基转移酶(AT_L)和酰基载体蛋白(ACP_L)三个功能域。研究人员通过生物信息学分析重建出12种祖先AT(AncAT)序列，并成功构建出保留天然活性的KS_QAncAT_2嵌合蛋白。这项创新性工作发表于《Nature Communications》，为多域蛋白结构研究开辟了新路径。

研究团队运用三大关键技术：1）祖先序列重建技术设计稳定性提升的AncAT结构域；2）化学交联探针固定KS_Q-ACP_L相互作用复合体；3）结合X射线晶体学(2.0?)和冷冻电镜单颗粒分析(2.7?)实现多尺度结构解析。

高分辨率晶体结构揭示保守催化机制
通过解析KS_QAncAT_2嵌合蛋白的2.0?晶体结构，发现AncAT_2域虽与天然AT_L域存在6?空间位移差异，但关键催化残基Ser666和底物识别模体His-Ala-Phe-His完全保守。结构比对显示KS_Q域的催化中心Gln197、His332、Thr334等关键残基空间构象与野生型完全一致，证实嵌合设计未影响核心催化功能。

冷冻电镜捕捉动态相互作用模式
突破性地获得三种KS_Q-ACP_L复合体冷冻电镜结构(2.68-2.73?)，首次揭示ACP_L存在"钟摆式"多构象状态。在C2对称的class 1结构中，ACP_L通过Asp979-His165和Arg971-Glu524盐桥与KS_Q/KAL相互作用；而在不对称的class 3结构中仅保留His165-Asp979盐桥，显示ACP_L在催化过程中存在动态重定位。分子动力学模拟进一步验证这种多态性相互作用是PKS催化域的固有特征。

结构-功能关联性验证
酶活分析显示KS_QAncAT_2嵌合体对丙二酰-ACP_L的脱羧活性(54 min^-1)与野生型(66 min^-1)相当，且AncAT_2域严格保持对丙二酰-CoA的特异性转移功能。差示扫描量热法证实嵌合蛋白解链温度(T_m)与野生型无显著差异，但结晶性能显著提升，晶体分辨率从野生型的2.6?提高至2.0?。

这项研究开创性地证明：针对多域蛋白特定结构域实施ASR改造，可显著提升其结构解析成功率，而无需牺牲天然功能。所发现的KS_Q-ACP_L动态相互作用模式为理解PKS链延伸机制提供了结构基础，其中ACP的构象可塑性可能与其在多个催化域间的穿梭功能密切相关。该方法学突破不仅适用于PKS研究，更为其他复杂多域蛋白（如非核糖体肽合成酶NRPS）的结构解析提供了普适性策略。研究还拓展了ASR技术的应用边界，首次证实局部结构域祖先化改造可独立于全局序列重建发挥作用，为蛋白质工程领域带来了新的技术维度。