空间约束二硫键重排延缓胰岛素聚集并增强神经毒性的机制研究

本研究针对胰岛素二硫键重排(DBS)如何影响其聚集途径和神经毒性的关键科学问题，通过结合离子淌度质谱(IM-MS)等先进技术，首次揭示了DBS可在长达19 ?的空间范围内产生异质交联寡聚体，延缓胰岛素聚集但最终形成β-折叠含量更高的纤维结构。研究发现DBS产物通过共价/非共价相互作用与天然胰岛素发生分子串扰，显著增强了对神经元和胰腺细胞的线粒体凋亡通路激活作用。该成果为胰岛素治疗应用中的质量控制提供了重要依据，并为蛋白质错误折叠疾病的机制研究提供了新视角。

胰岛素作为糖尿病治疗的核心药物，其稳定性问题一直是生物医药领域的重大挑战。在临床应用中，胰岛素易在注射部位形成淀粉样沉积，更令人担忧的是，帕金森病患者血清中已发现异常升高的胰岛素寡聚体水平。这些聚集体会引发神经退行性病变，甚至促进Tau蛋白积累。传统观点认为蛋白质聚集是个简单的线性过程，但最新证据表明，二硫键的动态重排(DBS)可能在其中扮演关键角色——就像蛋白质分子内部的"分子开关"，其异常操作可能导致灾难性后果。

南开大学的研究团队在《Nature Communications》发表的研究，首次系统揭示了胰岛素二硫键重排的空间限制规律及其病理学意义。通过创新的"碳酸氢盐加热法"，研究人员成功实现了空间距离约束下的二硫键重排，结合高分辨离子淌度质谱(IM-MS)和原子力显微镜等技术，绘制出从分子串扰到细胞毒性的完整图谱。研究发现，DBS产物虽然延缓了胰岛素聚集的初始阶段，但最终会形成更具神经毒性的β-折叠纤维结构，这一发现为理解蛋白质错误折叠疾病的分子机制提供了全新视角。

研究采用了多项关键技术：1) 碳酸氢盐加热法诱导空间约束的DBS反应；2) 非还原变性凝胶电泳和IM-MS表征DBS产物；3) ThT荧光监测聚集动力学；4) 圆二色谱和ATR-FTIR分析二级结构；5) 神经元和胰腺细胞模型评估神经毒性；6) 蛋白质组学分析凋亡通路。所有实验均设置三重复以确保可靠性。

【空间距离约束的胰岛素DBS】研究发现DBS可在长达19 ?的空间范围内发生，远超既往认知的9 ?限制。AlphaFold3预测的3D结构模型显示，胰岛素A/B链间可形成多种二硫键连接模式。非还原电泳和IM-MS证实，碳酸氢盐加热能有效产生分子量各异的交联产物，同位素分布分析精确鉴定了不同交联程度的物种。

【DBS延缓胰岛素聚集】ThT荧光动力学分析显示，1% DBS产物可使聚集半衰期从12.42小时延长至15.34小时。通过玻尔兹曼模型拟合发现，DBS主要抑制初级成核和延伸步骤，但最终促进β-折叠含量增加29.76%。原子力显微镜观察到，DBS处理组形成更长(14 h时p<0.0001)、更细的纤维束。

【DBS-胰岛素分子串扰】IM-MS捕获到胰岛素与DBS产物间的非共价相互作用特征峰(m/z 1638.36和1848.32)。串联质谱证实[AB-A]⁵⁺等复合物先解离非共价作用(<30V)，再断裂二硫键(>50V)。CCS测量显示非共价复合物的碰撞截面比共价形式大3.2-8.4%。

【DBS增强神经毒性】MTT实验显示，10% DBS处理使胰岛素纤维对N2a细胞的毒性在50μM时显著增强(p<0.001)。Western blot检测到Bax/Bcl-2比值升高(p<0.01)，流式细胞术显示凋亡率增加。蛋白质组学鉴定到887个定量蛋白，其中34个上调蛋白与线粒体膜通透性改变和凋亡通路相关。

这项研究确立了DBS在胰岛素聚集和神经毒性中的双重作用机制：一方面通过分子串扰延缓聚集动力学，另一方面促进形成更具毒性的β-折叠纤维结构。从应用角度看，该研究为胰岛素制剂的生产储存提供了关键质量控制参数——控制DBS过程可显著降低神经毒性风险。从科学价值看，研究提出的空间约束DBS模型为理解阿尔茨海默病等蛋白质错误折叠疾病提供了新思路。特别是发现DBS产物能通过线粒体凋亡通路选择性激活神经细胞死亡，这一发现将蛋白质化学修饰与细胞信号通路直接关联，为开发新型抑制剂指明了方向。正如研究者强调的，这项成果的意义不仅限于胰岛素系统，其揭示的二硫键动态调控原理可拓展至更广泛的蛋白质错误折叠研究领域。