整合转录组学与机器学习解析大肠杆菌K-12假设蛋白功能：从计算预测到实验验证

本研究针对微生物"暗物质"中大量未注释的假设蛋白(HPs)，通过整合转录组学、机器学习(OptICA算法)和in silico工具，系统解析了E. coli K-12中95个完全未表征HPs的功能，并实验验证了yhdN(热休克响应)、yeaC/ydgH(氧化应激)三个关键基因的功能，为微生物功能基因组研究提供了AI驱动的新范式。

　　

在微生物研究领域，大量"假设蛋白"(Hypothetical Proteins, HPs)如同未被破解的密码，即便在模式生物大肠杆菌K-12中，仍有2%的蛋白质组功能完全未知。这些分子暗物质严重阻碍了对细胞代谢网络和生物技术潜力的挖掘。传统实验验证方法效率低下，而单纯的计算预测又存在准确性不足的困境，如何系统破解这些HPs的功能成为亟待解决的难题。

Karlsruhe Institute of Technology和Helmholtz Society的研究团队在《Computational and Structural Biotechnology Journal》发表创新研究，通过多组学整合与人工智能技术，建立了从计算预测到实验验证的完整研究框架。研究人员首先严格筛选出95个完全未注释的E. coli K-12 HPs（标准包括：EcoCyc标记"未表征"、UniProt注释分1分、RegulonDB证据等级"弱"、EggNOG归类"S"或无双源同源物）。采用OptICA算法对779个高质量RNA-seq数据集进行独立成分分析，生成128个iModulon（独立调控模块），结合PANTHER GO注释、STRING蛋白互作网络、AlphaFold结构预测等12种生物信息学工具，构建了多层次功能预测体系。

关键技术包括：1) OptICA机器学习算法解析转录调控网络；2) 基于BW25113突变体的生长曲线实验验证（热休克50°C/7min，H₂O₂ 2.5mM氧化应激）；3) RNA-seq差异表达分析（DESeq2，log₂FC≥1.5，P_adj≤0.1）；4) 远程同源检测（HHblits+AFDB结构聚类）。

iModulon生成和分析
通过OptICA将90%已知基因和54%未表征HPs成功聚类，发现22个HPs具有已知调控因子（如yhdN受σ³²调控），29个属于新型调控模块。验证实验显示ΔyhdN在热休克后生长缺陷达18%（LB）和50%（氮限制M9），证实其参与热应激响应。

功能分析
32个HPs获高置信度注释（如yhdN与分子伴侣J-domain同源），29个获低置信度注释。实验验证显示：1) ΔyhdN中热休克基因bolA上调5.53倍；2) ΔyeaC在氧化应激下生长延迟25%，伴随运动基因fliF下调9.86倍；3) ΔydgH中氧化应激基因ghoS上调3.65倍。

差异基因表达
WT vs ΔyhdN分析发现213个上调基因中，tdcB（营养胁迫）和tnaA（蛋白折叠）显著高表达；ΔyeaC中氧化应激基因prpE上调4.75倍；ΔydgH中应激响应蛋白dsrB上调3.89倍，印证计算预测。

结论与展望
该研究开创性地将AI预测与实验验证相结合，使64%的未表征HPs获得功能线索，突破性地证实yhdN、yeaC、ydgH分别参与热休克响应和氧化还原平衡。所建立的分析框架可推广至微生物暗物质研究，为合成生物学和抗逆机制研究提供新工具。未来需扩展至代谢组/蛋白组数据，以破解剩余36% HPs的功能奥秘。