融合蛋白结构预测新突破：基于窗口化多重序列比对技术的精准预测方法

本研究针对嵌合蛋白结构预测准确性不足的问题，开发了窗口化多重序列比对（Windowed MSA）技术。通过独立计算支架蛋白与目标肽段的MSA并进行融合，显著提升了AlphaFold-2/3对融合蛋白结构的预测精度，在65%的测试案例中实现RMSD降低。该研究为人工设计融合蛋白提供了重要技术支撑。

　　

在蛋白质工程领域，人工设计的嵌合蛋白（将不同蛋白功能域进行融合）已成为生物医药研发的重要工具。然而，当前最先进的AlphaFold-2/3等预测系统在面对这类非天然融合蛋白时，其预测准确性却显著下降——这就像给一位擅长拼原版拼图的大师突然塞入混搭的碎片，结果往往不尽如人意。问题的核心在于，传统的多重序列比对（Multiple Sequence Alignment, MSA）方法在处理融合序列时，难以同时兼顾不同功能域的进化信息，导致共进化信号丢失。

为攻克这一难题，研究人员创新性地提出了窗口化MSA技术。该技术突破性地将融合蛋白的支架部分与目标肽段分开进行MSA检索，再通过智能拼接形成完整比对文件。就像为拼图大师分别提供两套完整的参考图纸，使其能同时看清每个功能域的进化轨迹。研究团队选取了SUMO2、GST等4种常用支架蛋白与51个高精度肽段（RMSD<1?）构建408组融合序列测试集，通过分子动力学模拟验证了融合后各结构域仍保持独立折叠的特性。

关键技术方法包括：1）基于50%序列相似度的非冗余肽段数据集构建；2）AlphaFold-2/3和ESMFold3多算法平行预测；3）MMseqs2服务器生成窗口化MSA；4）50ns分子动力学模拟验证结构稳定性。

研究结果
3.1 AlphaFold-3展现最优肽段预测性能
在394个肽段测试集中，AlphaFold-3以90个RMSD<1?的预测结果显著优于AlphaFold-2（34个）和ESMFold3（21个），证实其作为基准模型的可靠性。

3.2 支架环境导致预测准确性普遍下降
当高精度肽段（单独预测RMSD<1?）与支架蛋白融合后，所有预测模型的准确性均出现恶化，N端融合的误差尤为显著（RMSD平均增加2.3倍），暗示传统MSA方法在嵌合序列处理上存在系统性缺陷。

3.3 窗口化MSA技术恢复预测精度
通过独立生成支架与肽段的MSA后拼接，AlphaFold-3在65%的案例中实现严格更低的RMSD值。典型案例如GST-2LG4融合体系，肽段预测RMSD从7.2?降至0.9?，同时pLDDT置信度评分提升15-20个百分点。

这项研究揭示了当前蛋白质结构预测模型在非天然序列上的局限性，并提供了切实可行的解决方案。窗口化MSA技术不仅解决了实验生物学中常见的标签蛋白预测难题，更为多结构域蛋白的精准预测开辟了新路径。值得注意的是，该方法的优势在AlphaFold-3上体现最为显著，这与该模型更强的共进化信号提取能力相呼应。未来研究可进一步探索该方法在预测结构域间相互作用方面的潜力，为理性设计多功能融合蛋白提供更完整的计算框架。论文发表于《Computational and Structural Biotechnology Journal》，为计算结构生物学领域提供了重要的方法论创新。