DNA损伤应答通路调控Nrf2介导的氧化应激防御机制

本研究揭示了ATM-CHK2信号通路在氧化应激条件下调控Nrf2稳定性和转录活性的分子机制。研究人员通过多组学方法发现，ROS激活的CHK2通过磷酸化自噬适配蛋白p62（S349位点）和直接磷酸化Nrf2（S566/S577位点），协同促进Keap1-Nrf2解离并增强抗氧化基因表达。该研究不仅阐明了DDR通路与抗氧化防御的交叉调控机制，还为缺血再灌注损伤和肿瘤治疗提供了新靶点。

　　

在细胞应对氧化应激的复杂防御网络中，核因子E2相关因子2（Nrf2）作为关键的转录调控因子，负责激活数百种抗氧化基因的表达。然而长期以来，科学家们对细胞如何将氧化应激信号转化为Nrf2依赖的抗氧化反应这一过程仍存在认知空白。尤其令人困惑的是，尽管已知Kelch样ECH关联蛋白1（Keap1）通过泛素-蛋白酶体系统调控Nrf2的降解，但氧化应激条件下Nrf2稳定化和转录激活的具体分子机制尚未完全阐明。

中国医科大学的研究团队在《SCIENCE ADVANCES》发表的重要研究，首次揭示了DNA损伤应答（DDR）通路核心激酶CHK2在氧化应激防御中的非经典功能。研究人员发现，活性氧（ROS）通过激活ATM-CHK2级联反应，一方面促使自噬适配蛋白p62在S349位点磷酸化，增强其与Keap1的结合能力从而破坏Keap1-Nrf2相互作用；另一方面直接磷酸化Nrf2的S566/S577位点，双重调控机制共同提升Nrf2的稳定性和转录活性。

研究采用的主要技术包括：免疫共沉淀（Co-IP）分析蛋白互作网络、体外激酶实验验证磷酸化位点、质谱鉴定关键修饰位点、基因敲除小鼠模型（Chk2^?/?）验证生理功能，以及A549异种移植瘤模型评估治疗潜力。

【ROS-ATM-CHK2通路稳定氧化应激条件下的Nrf2】
通过代谢应激（缺氧和葡萄糖剥夺）模型，研究发现ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）可抑制ATM S1981和CHK2 T68的磷酸化，同时阻断Nrf2积累。基因敲除和药理学抑制实验证实，ATM-CHK2通路的激活是Nrf2稳定的必要条件。

【CHK2磷酸化p62的S349位点】
质谱分析鉴定出p62是CHK2的新型底物。体外实验显示CHK2通过FHA结构域与p62的Keap1相互作用区（KIR，346-384aa）结合，并在S349位点引发磷酸化。该修饰显著增强p62与Keap1的亲和力，从而竞争性抑制Keap1对Nrf2的泛素化降解。

【CHK2介导的p62磷酸化激活p62-Keap1-Nrf2通路】
在CHK2缺陷细胞中，氧化应激诱导的p62-Keap1结合及Nrf2去泛素化均被阻断。值得注意的是，p62 S349A突变体丧失了解离Keap1-Nrf2复合物的能力，导致下游抗氧化基因（HO-1、NQO1等）表达受阻。

【CHK2磷酸化Nrf2的S566和S577位点】
研究者首次发现Nrf2的Neh3结构域是CHK2的作用靶点。质谱鉴定出S566/S577双磷酸化位点，该修饰不改变蛋白稳定性，但通过荧光素酶报告基因检测证实，S566A/S577A双突变体（S2A）显著削弱Nrf2的转录激活能力。

【CHK2介导的Nrf2激活减轻肾缺血再灌注损伤并促进肿瘤存活】
在肾缺血再灌注损伤（IRI）模型中，Chk2^?/?小鼠表现出更严重的肾功能损伤（血清肌酐和尿素氮升高），同时伴随Nrf2靶基因表达下降。相反，在肿瘤治疗模型中，CHK2抑制剂BML-277与顺铂联用可协同抑制A549移植瘤生长，而Nrf2 S2A突变肿瘤对化疗药物的敏感性显著增强。

这项研究的重要意义在于：首次建立DDR通路与经典抗氧化防御的分子联系，阐明CHK2通过"双轨制"调控机制（p62磷酸化和Nrf2直接磷酸化）增强细胞抗氧化能力的全新范式。在转化医学层面，研究不仅为缺血再灌注损伤提供潜在治疗靶点，还揭示肿瘤耐药的新机制——靶向CHK2-Nrf2轴可增强肿瘤对氧化应激诱导治疗的敏感性。值得注意的是，该研究发现的S566/S577磷酸位点在哺乳动物中高度保守，提示其在进化上的重要性，为开发选择性Nrf2调节剂奠定理论基础。