干扰素信号通路抑制促进兔杯状病毒在胆管类器官培养体系中的复制

这篇研究通过使用干扰素(IFN)抑制剂鲁索替尼(Ruxolitinib, Rux)显著提高了兔出血症病毒(RHDV)在肝源类器官培养系统中的复制效率，首次实现了该病毒的连续传代培养。研究揭示了IFN信号通路在限制RHDV复制中的关键作用，并通过单细胞RNA测序证实类器官主要由胆管细胞(Cholangiocytes)组成，为研究这类难以培养的杯状病毒(Caliciviridae)提供了重要工具平台。

　　

【兔肝类器官来源的单层细胞主要为胆管细胞】
单细胞RNA测序分析揭示，兔肝类器官衍生的单层细胞高度表达胆管细胞标志物EPCAM和KRT19，而成熟肝细胞标志物ALB、HNF4A和SLC10A1表达水平较低。值得注意的是，这些细胞同时表达胆管发育关键转录因子HES1，表明其具有未成熟胆管细胞特性。这一发现修正了既往认知，证实RHDV可感染胆管细胞这一新型靶细胞类型。

【Rux增强RHDV2在单层细胞中的复制】
Janus激酶(JAK)抑制剂Ruxolitinib(Rux)的加入使RHDV2病毒载量提升约1 log₁₀。实验显示，即使在感染后1小时添加4 μM Rux仍能显著促进病毒复制。免疫荧光检测发现VP60阳性细胞比例从对照组的5%提升至Rux处理组的25%。值得注意的是，Rux还表现出促进细胞贴壁生长的"副作用"，使单层细胞形态更稳定。细胞毒性实验证实1-16 μM浓度范围内Rux无显著细胞毒性。

【Rux抑制感染细胞的干扰素诱导基因表达】
定量PCR分析显示，RHDV2感染显著上调干扰素刺激基因(ISGs)GBP1和IFIT1的表达（较mock组增加8-10倍），而Rux处理使这些基因表达降低60-70%。MX1基因虽未达统计学差异，但呈现相似趋势。这些数据证实Rux通过阻断JAK-STAT信号通路有效抑制了RHDV触发的先天免疫反应。

【Rux实现RHDV的连续传代培养】
突破性进展体现在Rux处理使RHDV1和RHDV2均能完成连续4代传代培养，每代病毒滴度均接近初始接种量（10⁷ copies/μL）。全基因组测序发现传代过程中出现了衣壳蛋白(VP60)突出域(P2)的氨基酸变异：RHDV1第913位苏氨酸→脯氨酸(T913P)，RHDV2第1040位苏氨酸→异亮氨酸(T1040I)。这些变异在自然流行毒株中已有报道，提示细胞培养可能正向选择预存适应性变异。

【讨论与展望】
该研究建立了首个支持RHDV连续传代的培养系统，解决了困扰该领域40年的技术瓶颈。发现胆管细胞作为新型靶细胞，为理解病毒体内扩散途径提供了新视角。Rux的双重作用——既抑制IFN信号又促进细胞生长，为类器官培养提供了优化方案。这些突破将为疫苗研发、生物防治剂筛选及病毒基础研究提供关键平台。值得注意的是，VP60蛋白变异提示连续传代可能获得更适合体外培养的病毒株，这为定向进化研究开辟了新途径。