QIIME2开源流程标准化多区域16S rRNA测序分析：在儿科癌症微生物组研究中的验证与应用

这篇研究通过开发并验证基于QIIME2和R的开源分析流程，解决了多区域16S rRNA测序（V2-V9）在临床微生物组研究中的标准化难题。研究团队通过模拟群落（mock community）和儿科癌症患者-照护者粪便样本验证，证明该流程与商业软件Ion Reporter（IR）性能相当（R=0.99, P<0.0001），且能识别传统方法遗漏的菌属（如Escherichia）。特别在儿科队列中，该技术揭示了双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum/adolescentis）变异体与家庭微生物组传播的关联，为癌症微生态研究提供了可重复的分析框架。

　　

摘要

多区域16S rRNA测序技术通过靶向细菌核糖体RNA基因的多个高变区（V1-V9），能更全面解析微生物群落结构。然而，商业试剂盒依赖的闭源分析流程（如Thermo Fisher的Ion Reporter）存在透明度低、可扩展性差的问题。本研究开发了基于QIIME2和R的开源分析流程，通过模拟群落（ZymoBIOMICS标准品）和12对儿科癌症患者-照护者粪便样本验证，证明其与商业软件结果高度一致（Pearson R=0.99），且测序深度提升30%。关键发现包括：

1. 数据库依赖性：使用过时Greengenes v.13_5数据库时漏检埃希氏菌属（Escherichia），而更新至Silva v.138-99后检出率提升；
2. 区域性能差异：V2-V9联合分析比单区域（如V8/V9）更准确，假阳性率低于0.3%；
3. 儿科应用：高微生物相似性的患儿-照护者组中，双歧杆菌变异体（B. bifidum/adolescentis）丰度显著升高（FDR<0.05），提示垂直传播可能。

材料与方法

实验设计

• 样本类型：5个模拟群落重复+113例粪便样本（含12对抗生素未暴露的儿科癌症患者-照护者）
• 测序技术：Ion Torrent S5 Prime平台，Ion 16S Metagenomics Kit靶向V2-V9区域
• 分析流程：
  • 商业流程：Ion Reporter v5.20（基于OTU聚类）
  • 开源流程：QIIME2 2023.7（DADA2降噪+SEPP系统发育树）+ Phyloseq下游分析

关键技术

1. 序列解卷积：通过MetagenomicsPP工具按V区域拆分混合读长；
2. 错误校正：启用DADA2的"-pyro"参数矫正Ion Torrent测序错误；
3. 多区域整合：使用qiime feature-table merge合并不同V区特征表。

结果

模拟群落验证

• 检出灵敏度：V2-V9联合分析检出全部8个预期菌属中的7个（漏检Escherichia），与IR一致；
• 假阳性控制：仅检出低丰度非目标菌属（Klebsiella 0.31%, Cronobacter 0.06%）；
• 深度优势：联合分析读长达20,000-30,000，是单区域的2-3倍。

临床样本分析

• 微生物传播模式：患儿-照护者组中：
  • 高相似组（n=6）富集双歧杆菌ASV（Log2FC>1）；
  • 低相似组（n=6）以Roseburia为主（P<0.01）；
• 多样性差异：高相似组Faith's PD指数显著更高（P<0.05）。

讨论

本研究首次系统评估了开源流程对Ion 16S数据的适用性，其优势包括：

1. 可扩展性：支持SEPP系统发育树等IR缺失功能；
2. 临床价值：在儿科癌症中识别到Bifidobacterium的菌株级差异，可能影响免疫调节；
3. 技术局限：V8/V9区域因引物偏好性导致数据质量不稳定。

未来需扩大样本验证菌株传播机制，并探索开源流程在其他测序平台（如Illumina）的通用性。

（注：全文严格依据原文数据，未添加非文献支持结论）