基于叶绿体atpF基因的物种特异性PCR与HRM技术快速鉴别金钱草及其商品药材掺伪研究

本研究针对传统中药金钱草(Lysimachia christinae)市场掺伪严重的问题，开发了基于叶绿体atpF基因变异的物种特异性PCR和高分辨率熔解曲线(HRM)检测技术。通过比较叶绿体基因组发现独特的atpF-X区域，建立优化反应体系(PCR:60℃退火/33循环/50?ng/μL DNA; HRM检测限0.5?ng/μL)，在60份商品样本中检出51.67%掺伪率(主要为广金钱草等)。该方法为中药材市场监管提供了快速精准的技术工具。

　　

在传统中医药领域，金钱草(Lysimachia christinae)作为治疗胆结石和胆囊炎的重要药材，其市场需求量持续增长。然而由于形态相似物种众多、野生资源有限，市场上充斥着以广金钱草(Desmodium styracifolium)、聚花过路黄(L. congestiflora)等近缘或同名异物品种的掺伪现象，严重影响临床疗效。更棘手的是，这些掺伪品与正品在化学成分和药理作用上存在显著差异——正品金钱草特有的酚酸类成分具有选择性利胆作用，而广金钱草则主要针对泌尿系结石，完全不具利胆功效。面对传统形态鉴定方法在加工药材中失效、常规DNA条形码(如ITS2、psbA)对近缘种分辨率不足的困境，安徽医科大学联合中国医学科学院药用植物研究所重庆分所的研究团队开展了一项创新性研究，成果发表在《Industrial Crops and Products》期刊。

研究人员首先通过叶绿体基因组比较分析，从金钱草及其3个近缘种(L. patungensis、L. hemsleyana、L. congestiflora)中筛选出高变异的atpF-X区域，据此设计物种特异性引物。采用梯度优化确定最佳PCR条件(退火温度60℃、引物浓度10μM、循环数33次)，建立可检测50 ng/μL DNA的PCR方法；同时开发出灵敏度达0.5 ng/μL的HRM检测体系，通过75.2±0.3℃的特征熔解峰实现鉴别。研究收集了20份基原植物样本和60份电商平台商品，样本覆盖四川、重庆等主产区及常见掺伪物种。

"叶绿体基因组比较揭示高变atpF位点"部分显示，mVISTA分析发现非编码区序列变异度显著高于保守蛋白编码区，其中atpF基因区存在金钱草特有的36 bp插入片段。"物种特异性PCR体系优化"结果表明，添加5%甘油可有效抑制引物二聚体，33次循环能在保证效率的同时避免过度扩增。"HRM技术优化"显示该方法在0.5 ng/μL浓度下仍能保持特征熔解曲线，且实验室间重复性良好。

最引人关注的是"商品样本鉴定应用"结果：60份标称"金钱草"的商品中，仅29份(48.33%)为真品，29份为广金钱草，另有聚花过路黄和点腺过路黄各1份。这种近50%的掺伪率暴露出严峻的市场乱象，特别是"广金钱草"与"金钱草"的名称混淆成为掺伪温床。研究同时发现，该方法在检测中药成方制剂时受加工过程中DNA降解和辅料干扰影响较大，提示未来需开发更短小的DNA迷你条形码。

该研究的突破性在于将NGS技术筛选的叶绿体特异性标记与传统PCR、HRM技术相结合，创建了一套快速(1.2小时内)、低成本的质量控制方案。相较于常规DNA条形码，该方法对金钱草及其近缘种的鉴别准确率达100%，且操作简便适合基层推广。这不仅为《中国药典》相关标准的修订提供了技术储备，更构建了一个可推广至其他易混淆中药材的鉴定框架，对保障临床用药安全、维护中医药市场秩序具有重要实践价值。