U富集元件驱动3'UTR大规模平行报告基因检测中的普遍性隐蔽剪接及其调控机制解析

本研究揭示了3'非翻译区(3'UTR)中AU富集元件(AREs)通过激活隐蔽剪接位点，在mRNA表达调控中发挥关键作用。研究人员通过重新分析PTRE-seq(转录后调控元件测序)数据，发现U富集序列能位置依赖性地调控5'和3'剪接位点选择，导致报告基因表达量发生显著变化。这项工作不仅阐明了隐蔽剪接对大规模平行报告基因检测(MPRA)结果的潜在影响，更为理解RNA剪接调控机制提供了新见解，对改进基因表达研究方法和解析疾病相关剪接异常具有重要意义。

　　

在基因表达调控的复杂网络中，3'非翻译区(3'UTR)扮演着举足轻重的角色。这些看似"沉默"的RNA序列通过招募各种反式作用因子，调控mRNA的剪接、多聚腺苷酸化、翻译和降解等过程。然而，这些调控元件背后的序列密码和分子机制仍有许多未解之谜。近年来，大规模平行报告基因检测(MPRA)技术因其高通量和灵活性，成为研究非编码序列功能的重要工具。但这项技术也面临一个长期被忽视的问题——隐蔽剪接(cryptic splicing)可能严重影响实验结果的可信度。

来自美国华盛顿大学医学院(Washington University School of Medicine)的Khoa Dao、Sergej Djuranovic和Anthony M. Mustoe研究团队在《Nature Communications》发表的研究，通过重新分析PTRE-seq(转录后调控元件测序)数据，意外发现了3'UTR中U富集元件(AREs)驱动的普遍性隐蔽剪接现象。这项研究不仅揭示了隐蔽剪接对MPRA结果的潜在影响，更深入解析了U富集序列在剪接调控中的核心作用。

研究人员主要采用了四种关键技术方法：(1)重新设计引物对PTRE-seq文库进行深度测序分析；(2)建立生物信息学流程定量隐蔽剪接事件；(3)使用SpliceAI算法预测剪接位点；(4)通过定点突变和RT-PCR验证关键剪接位点功能。研究队列包括HeLa、HEK293、SH-SY5Y和U87四种细胞系。

研究结果部分包含以下重要发现：

"PTRE-seq MPRA文库存在多重意外的大小异质性"部分揭示，通过"延伸"引物测序发现了大量短片段产物，这些产物源于隐蔽剪接而非克隆假象。DNA测序显示30%的读段含有回文插入，但RNA中仅5-17%保留该插入，表明插入产物可能影响RNA稳定性。

"PTRE-seq MPRA文库存在广泛的隐蔽剪接"部分证实，尽管报告基因未设计剪接位点，但19%的RNA读段显示精确的GT-AG剪接特征。剪接分数在生物重复间高度一致(R=0.98)，且在四种测试细胞系中呈现相似模式，表明隐蔽剪接是组成性现象。

"剪接发生在多种弱供体和受体位点"部分发现，165个剪接事件使用GFP终止密码子附近的隐蔽5'剪接位点，尽管这些位点强度仅为人基因组注释位点的1百分位。另一组剪接使用Pumilio识别元件(P)中的供体位点。3'剪接受体位点则分布在所有调控模块(除AREs外)，均含有AG二核苷酸和上游U富集区。

"AU富集元件激活隐蔽剪接并决定剪接位点选择"部分阐明，隐蔽剪接严格依赖3'UTR中至少一个ARE模块。内含子区ARE数量增加会提升剪接效率，而外显子区ARE则抑制相邻剪接位点使用。特别值得注意的是，剪接受体通常位于3'端ARE下游最近AG位点，即使上游存在更强受体位点也会被忽略。

"隐蔽剪接通过多种机制调控报告基因表达"部分建立了数学模型，发现剪接通过两种机制影响表达：(1)切除3'UTR中的调控元件(RE-excision)使剪接异构体稳定性提高40-60%；(2)当剪接分数>90%时，转录速率增强2-3倍。这解释了为何ARE在不同位置表现出或增强或抑制表达的"矛盾"现象。

"隐蔽剪接假象常见于其他已发表MPRA"部分通过SpliceAI分析预测，Griesemer等四个代表性MPRA研究中16-50%的报告基因可能发生隐蔽剪接。RT-PCR验证显示预测准确率达92%。重要的是，12%被鉴定为功能性的疾病相关SNP可能受剪接假象影响。

研究结论部分强调，这项工作揭示了U富集序列作为剪接主要驱动力的核心作用，阐明了隐蔽剪接对MPRA研究的广泛影响，并提出了改进实验设计的解决方案。研究发现GFP终止密码子附近的隐蔽剪接位点是普遍问题，建议通过同义突变(如AAG→AAA)消除该位点。此外，研究还表明U富集序列不仅能作为多聚嘧啶区激活剪接，还能位置依赖性地调控剪接位点选择——内含子区ARE增强剪接，而外显子区ARE则抑制剪接。这些发现不仅对改进MPRA设计具有直接指导意义，也为理解疾病相关剪接异常提供了新视角。

这项研究的创新性在于首次系统揭示了MPRA中隐蔽剪接的普遍性和分子机制，挑战了"隐蔽剪接是罕见现象"的传统认知。通过整合实验验证和计算预测，研究团队建立了一套识别和校正剪接假象的方法体系。特别值得注意的是，研究发现简单的U富集序列就能激活高效剪接，这一发现可能为理解人类疾病中广泛存在的剪接异常提供新线索。该研究强调，未来MPRA研究应结合全长测序和剪接预测算法进行严格质控，以确保实验结果可靠性。