小麦抗病育种新突破：多重竞争性等位基因特异性PCR技术助力赤霉病和白粉病抗性基因聚合

本研究针对小麦赤霉病(FHB)和白粉病(PM)协同防控难题，开发了可同时检测Fhb7和Pm21抗性基因的多重KASP(Multi-KASP)系统。通过优化引物设计和荧光标记策略，实现在单反应中完成双基因分型，准确率达100%。该技术成功应用于615株BC2F2群体筛选，培育出兼具双抗特性的小麦新品系，为多基因聚合育种提供了高效解决方案。

　　

【研究背景】
小麦作为全球20%热量和蛋白质的主要来源，正面临赤霉病(Fusarium head blight, FHB)和白粉病(powdery mildew, PM)的双重威胁。前者不仅造成减产，其产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)毒素更危害人畜健康；后者则通过破坏光合作用导致10-50%的产量损失。尽管化学防治有效，但面临成本高、环境污染和病原菌抗药性等问题。传统育种中，抗性表型筛选受环境干扰大，而常规分子标记技术如KASP每次仅能检测单个基因，难以满足多基因聚合需求。

扬州大学江苏省作物基因组学与分子育种重点实验室的研究团队在《BMC Plant Biology》发表论文，创新性地开发了多重竞争性等位基因特异性PCR(Multi-KASP)系统。该系统突破传统技术局限，首次实现单反应同步检测非同源基因Fhb7和Pm21，为小麦多抗育种提供高效技术支撑。

【关键技术】
研究采用CTAB法提取DNA，针对Fhb7的ORF区和Pm21第三外显子设计特异性引物，5'端分别标记HEX和FAM荧光。通过优化引物浓度(12μM正向/15μM反向)和退火温度(61-55℃梯度下降)，建立10μL反应体系。使用ABI ViiA 7实时PCR系统进行检测，通过40个BC₂F₂株系的MBH1和GST(26102 F/R)标记验证准确性，并结合单小穗注射法和孢子喷雾法进行表型验证。

【研究结果】

1. Multi-KASP系统开发
   设计两对特异性引物分别靶向Fhb7(130-207bp ORF区)和Pm21(6VS染色体第三外显子)，通过不同荧光标记实现双基因同步检测。如图1所示，系统可清晰区分四种基因型：仅Pm21(蓝色簇)、仅Fhb7(红色簇)、双基因(绿色簇)和无基因型(紫色簇)。

1. 技术验证
   使用已知基因型的10个小麦品种和Th. elongatum、D. villosum供体材料验证，结果与预期完全一致(图3)。40个BC₂F₂株系的MBH1和GST标记验证显示100%吻合度，证实该系统可准确识别纯合/杂合基因型。

2. 抗性表现
   携带Pm21的株系对PM抗性等级(IT)为0-1级，而Fhb7阳性株系的FHB病小穗率显著降低。双基因聚合株系对两种病害均表现高抗性(图5)，证实基因叠加效应。

【结论与意义】
该研究创建的多重KASP系统具有三大创新点：(1)突破传统KASP单基因检测限制，通量提升100%；(2)仅需常规荧光通道，成本降低40%；(3)适用于非同源基因检测，灵活性显著增强。通过将该技术应用于育种实践，成功培育出兼具Fhb7和Pm21的小麦新品系，为解决长江中下游麦区主要病害协同防控提供了关键技术支撑。

研究建立的标准化操作流程可推广至其他作物多基因聚合育种，特别是对野生近缘物种抗性基因的快速转育具有重要参考价值。未来通过引入更多荧光标记(如VIC、ROX)，该系统有望实现三基因同步检测，进一步推动分子设计育种效率革新。