单细胞抗原受体测序揭示猪流感感染中NKT细胞对肺组织TCR/BCR受体库的调控机制

本研究针对猪流感免疫应答机制不清的问题，开发了兼容10xGenomics平台的猪特异性TCR/BCR富集引物，通过单细胞测序解析了CD1D-/-与CD1D+/-猪在异源流感病毒(IAV)感染后的肺组织免疫受体库特征。发现再感染猪存在更多具有激活表型的T细胞克隆，揭示了NKT细胞通过调控单核/巨噬细胞NF-κB等通路增强二次免疫应答，为猪疫苗设计及人类呼吸道疾病模型建立提供了新工具。

　　

流感病毒(IAV)对畜牧业和公共卫生构成持续威胁，而猪作为重要的流感病毒"混合器"和人类疾病模型，其免疫应答机制却长期缺乏高精度的研究工具。传统方法难以解析肺组织微环境中T/B细胞的克隆动态，特别是先天样T细胞（如NKT细胞）如何调控适应性免疫仍存争议。CD1d分子递呈的脂质抗原可激活NKT细胞，但其在猪流感免疫中的功能证据链尚未完整。

美国密苏里大学国家猪资源研究中心(NSRRC)的研究团队在《Communications Biology》发表突破性成果。研究人员开发了首个兼容10xGenomics平台的猪特异性TCR/BCR单细胞测序体系，通过对CD1D基因编辑猪的肺组织细胞和支气管肺泡灌洗液进行多时间点分析，揭示了NKT细胞缺失对免疫受体库的影响机制。

关键技术包括：1）设计21对猪特异性VDJ引物覆盖所有IGHG亚型；2）对12只CD1D^-/-/CD1D^+/-猪进行异源IAV攻毒实验（H1N1 A/California/04/2009和H1N1 A/Missouri/CS20N08/2020）；3）联合scRNAseq与免疫组库分析45,850个肺组织细胞；4）纵向追踪3只疫苗接种猪的肺灌洗液T细胞克隆动态。

单细胞RNA测序分析流感病毒感染基因编辑猪
UMAP聚类鉴定出28个细胞亚群，其中CD8⁺组织驻留记忆T细胞(TRM)在二次感染(2X)的CD1D^+/-猪中显著增加。差异基因分析显示，CD1D^+/-猪在二次感染时上调3241个基因，远超CD1D^-/-组(1162个)，尤其在细胞毒性T细胞(cluster 5)和NK细胞(cluster 11)中富集到C型凝集素受体和NF-κB通路。单核/巨噬细胞(cluster 17)在CD1D^+/-猪中持续高表达I类MHC抗原递呈相关基因。

肺T淋巴细胞TCR受体库特征
70%的TRB序列能匹配IMGT数据库注释，Vβ-Jβ重组模式显示TRBJ1-2 * 01等5个片段占优势。通过SLA单倍型分析将12只猪分为6组，发现MHC遗传背景显著影响VDJ选择。2X感染的CD1D^+/-猪存在最多扩增克隆（如克隆#1含12个细胞），这些克隆富集于CD8⁺ TRM群体，其CDR3β长度较1X组显著缩短，提示抗原驱动选择。

肺B淋巴细胞BCR受体库特征
IGHG1占所有IgG亚型的76%，而IGHG5-2在二次感染中比例升高。与人类不同，猪使用6个VH片段(如V1-15)和单一JH片段构成90%的BCR多样性。扩增克隆主要见于浆细胞(cluster 15)，但最大克隆仅含4个细胞，反映B细胞应答较弱。

肺灌洗液T细胞的纵向追踪
在疫苗接种后攻毒的FLU1/FLU2猪中，鉴定到跨时间点持续存在的克隆，如携带CDR3β序列"ASSPGQGYEQ"的克隆与人类IAV基质蛋白特异性TCR完全匹配。免疫arch分析发现ASSL和SSLV四肽模体在疫苗组显著富集。

该研究建立了首个猪单细胞免疫组库分析标准，证实NKT细胞通过增强APC功能促进异源免疫应答。发现的保守TCR克隆为跨物种疫苗设计提供靶点，而精简的猪BCR架构挑战了传统多样性理论。技术体系可拓展至猪瘟、PRRSV等重要动物疾病研究，并为人类呼吸道感染免疫研究提供新模型。特别值得注意的是，在缺乏NKT细胞时，CD8⁺ TRM的克隆扩增减少50%，这为解释流感疫苗效力差异提供了机制线索。