通过亚硝酸诱变和固态发酵优化提升米曲霉L-天冬酰胺酶产量的研究及其工业应用价值

本研究针对L-天冬酰胺酶(LA)在白血病治疗和食品工业中的重大需求，通过亚硝酸诱变和固态发酵工艺优化，显著提高了米曲霉(Aspergillus oryzae)的LA产量。研究人员从土壤中筛选出高产菌株，利用甘蔗渣作为廉价基质，通过化学诱变获得突变株NA-cysL-C4，最终使LA产量提升至16.122±0.81 U/g，较原始菌株提高2.07倍。该研究为工业化生产LA提供了经济高效的技术方案，具有重要的临床应用和食品安全生产价值。

　　

在癌症治疗和食品工业领域，L-天冬酰胺酶(L-asparaginase, LA)一直扮演着关键角色。这种能够催化L-天冬酰胺水解的酶，通过切断肿瘤细胞生长必需的外源氨基酸供应，成为治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)的重要药物。同时，在食品加工中，LA能有效减少高温烹饪过程中致癌物丙烯酰胺的形成。然而，传统细菌来源的LA存在免疫原性副作用等问题，且工业化生产成本居高不下，促使科学家将目光转向更安全、经济的真菌来源。

面对这一挑战，巴基斯坦拉合尔GC大学工业生物技术研究所的Sikander Ali研究团队在《Microbial Cell Factories》发表了一项创新研究。他们通过系统的菌株筛选、工艺优化和基因改造，成功将米曲霉(Aspergillus oryzae)的LA产量提升至工业应用水平。这项研究不仅解决了真菌LA产量低的瓶颈问题，还开创性地利用农业废弃物甘蔗渣作为发酵基质，实现了环保与经济的双重效益。

研究人员采用了多学科交叉的研究方法：从巴基斯坦不同生态环境采集土壤样本，通过稀释涂布法分离35株真菌；建立改良Czapek-Dox琼脂(mCDA)快速筛选体系；优化固态发酵(SSF)参数包括底物装载量、水分含量和培养时间；运用亚硝酸(NA)化学诱变和L-半胱氨酸抗性筛选获得高产突变株；通过扫描电镜(SEM)观察菌株形态变化；采用人工神经网络(ANN)模型预测最佳培养条件。

研究结果部分，"Isolation and screening of fungal isolates"显示，从五类生态区域分离的35株真菌中，米曲霉ISL-3和黑曲霉ISL-9表现出最强的LA活性，分别为0.878±0.04 U/g和0.876±0.04 U/g。通过扫描电镜分析发现，突变株NA-cysL-C4的菌丝结构发生显著变化，呈现更为密集的交错网络，这可能与其代谢通量改变相关。

"Optimization of selected isolates"部分详细阐述了工艺优化过程。研究发现5g甘蔗渣底物、9mL 0.1N H₂SO₄作为湿润剂、72小时培养和2mL接种量为最佳条件，使ISL-3的LA产量提升至2.395±0.12 U/g。温度实验表明30℃为最适培养温度，而突变株NA-cysL-C5在40℃仍保持较高活性，显示出更好的热稳定性。

"Improvement of selected strain of A. oryzae"章节记录了关键的遗传改造突破。15分钟9mM亚硝酸处理获得的突变株NA-t3活性达4.479±0.22 U/g；进一步筛选出能耐受8ppm L-半胱氨酸HCl的NA-cysL-C4突变株，活性提升至4.498±0.22 U/g。添加3mM MgSO₄·7H₂O、0.2%硝酸铵和0.125% 2-巯基乙醇(2-ME)后，最终突变株产量飙升至16.122±0.81 U/g，较原始菌株提高2.07倍。

"Partial precipitation of LA"部分展示了纯化工艺成果。35%和75%硫酸铵分级沉淀结合透析和DEAE纤维素层析，使酶纯度显著提高，SDS-PAGE显示单一条带，分子量约120kDa。突变株的比活性达到0.54 U/mg，回收率为47%，为工业化生产奠定了基础。

这项研究的创新价值体现在多个维度：首次系统报道了亚硝酸诱变结合L-半胱氨酸抗性筛选在提高真菌LA产量中的应用；建立了基于农业废弃物的低成本固态发酵体系；通过人工神经网络模型实现了培养条件的智能预测。这些突破不仅为白血病治疗提供了更经济的酶制剂来源，也为食品工业中丙烯酰胺的控制提供了新思路。特别值得注意的是，该研究采用的米曲霉是公认安全(GRAS)菌株，避免了细菌来源LA的免疫原性问题，具有更广阔的临床应用前景。未来，这一技术路线可望推广至其他重要工业酶的生产，推动生物制造产业的可持续发展。