基于CRISPR/Cas9技术构建人源化FcRn基因敲入小鼠模型及其在治疗性抗体药代动力学研究中的应用

本研究针对现有转基因小鼠模型因使用非天然启动子导致人FcRn(hFcRn)表达异常、无法准确预测治疗性抗体药代动力学(PK)的难题，通过CRISPR/Cas9技术成功构建了内源性调控的hFcRn基因敲入(hiFcRn)小鼠模型。该模型将hFcRn cDNA精准整合至小鼠Fcgrt基因座，完全替代小鼠FcRn(mFcRn)表达，并保留天然启动子的调控功能。研究证实hiFcRn小鼠能更准确地反映pH依赖性的人IgG-FcRn相互作用特征，为治疗性抗体和Fc融合蛋白的临床前评价提供了更接近人类的实验平台。

　　

在生物医药领域，单克隆抗体药物已成为治疗癌症、自身免疫疾病等重大疾病的重要武器。这类药物的"长寿秘诀"在于其独特的新生儿Fc受体(FcRn)回收机制——通过pH依赖性的结合-解离循环，抗体像被安装了"生命延长器"般避免被溶酶体降解。然而，当科学家们试图用小鼠模型预测抗体在人体内的代谢规律时，却遭遇了"水土不服"的困境：由于人和小鼠FcRn存在显著的种属差异，特别是对IgG的结合特性不同，导致传统动物模型难以准确预测治疗性抗体在人体内的半衰期。

更棘手的是，现有表达人FcRn的转基因小鼠模型存在明显缺陷。这些模型多采用外源启动子（如CAG合成启动子或人FcRn自身启动子）驱动hFcRn表达，不仅可能破坏组织特异性表达模式，还因随机整合导致表达水平异常。这就像用失真的地图导航，使抗体药物开发面临巨大不确定性。为此，延世大学生命科学与生物技术学院的研究团队另辟蹊径，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，开发了全新的人源化FcRn基因敲入(hiFcRn)小鼠模型。

研究人员采用的主要技术方法包括：通过CRISPR/Cas9系统将包含同源臂和hFcRn基因的3174 bp供体序列精准插入小鼠Fcgrt编码区；保留内源性信号肽确保正确蛋白转运；采用SV40晚期多聚腺苷酸化信号增强mRNA稳定性；通过ELISA和Western blot定量检测hFcRn表达；使用三种具有不同pH依赖性结合特性的曲妥珠单抗-Fc变体（WT、IHH和PFc29）进行药代动力学分析。

研究结果部分显示：

在"人FcRn敲入(hiFcRn)小鼠模型的构建与验证"中，通过RT-qPCR证实纯合hiFcRn小鼠完全用FCGRT替代了Fcgrt表达，mRNA水平与野生型小鼠相当。ELISA检测显示，hiFcRn小鼠肺和肝组织中hFcRn表达量分别为10.69±0.81和34.78±2.32 pmol/g组织，呈现典型的组织分布差异。Western blot进一步证实hFcRn蛋白成功表达。

在"具有不同pH依赖性结合特性的人IgG Fc变体的构建"部分，研究成功制备了三种曲妥珠单抗-Fc变体：野生型(WT)、IHH突变体（I253A/H310A/H435A）和PFc29。ELISA结合实验证实，WT在核内体pH(6.0)下对mFcRn的结合高于hFcRn；IHH突变体完全丧失结合能力；而PFc29在两种pH条件下均显示增强的hFcRn结合。

关键的"hiFcRn小鼠作为预测人IgG抗体药代动力学的稳健模型"结果显示：在hiFcRn小鼠中，曲妥珠单抗-WT的半衰期(8.3±1.41天)显著短于C57BL/6小鼠(13.10±4.59天)，反映了hFcRn与mFcRn的结合差异；而PFc29在hiFcRn小鼠中表现出18.93±3.46天的超长半衰期，与食蟹猴数据一致，验证了该模型对工程化Fc变体的预测能力。

研究结论指出，hiFcRn小鼠模型通过内源性调控实现了hFcRn的生理性表达，克服了现有转基因模型的局限性。该模型不仅能更准确地预测治疗性抗体的药代动力学，还为Fc工程化策略的优化提供了可靠平台。特别值得注意的是，相比Jackson实验室的Tg32模型，hiFcRn小鼠显示出更接近生理的hFcRn表达水平，避免了过表达可能导致的偏差。这项发表于《Scientific Reports》的研究，为抗体药物的临床前开发提供了关键工具，将助力更安全有效的抗体疗法问世。正如作者Han-Woong Lee和Sang Taek Jung团队强调的，这种"基因原位替换"策略代表了一种更精准的人源化动物模型构建范式，未来可拓展至其他重要受体的人源化研究。