细胞穿透性不对称siRNA靶向NRL在视网膜变性中的体内疗效研究：通过杆状细胞向锥状细胞转分化实现视觉功能保护

针对视网膜退行性疾病治疗难题，研究人员开发了靶向神经视网膜亮氨酸拉链(NRL)的细胞穿透性不对称小干扰RNA(cp-asiNRL)，通过诱导杆状细胞向锥状细胞转分化，在视网膜色素变性(RP)和新生血管性年龄相关性黄斑变性(nAMD)小鼠模型中显著提高视网膜功能，为无创治疗视网膜变性提供了新策略。

　　

视网膜退行性疾病是全球致盲的主要原因，其中视网膜色素变性(RP)表现为周边杆状光感受器进行性丧失，而年龄相关性黄斑变性(AMD)则主要导致中央视力丧失。尽管已有基因治疗和人工视网膜等尝试，但现有疗法存在免疫反应、递送效率低等局限。韩国建国大学医学院眼科系的研究团队在《Scientific Reports》发表创新研究，开发了一种靶向神经视网膜亮氨酸拉链(NRL)的细胞穿透性不对称小干扰RNA(cp-asiNRL)，通过诱导杆状细胞向锥状细胞转分化来治疗视网膜变性。

研究采用三种小鼠模型：C57BL/6J野生型、激光诱导的脉络膜新生血管(nAMD)模型和Rho^P23H/+转基因RP模型。通过单次玻璃体内注射cp-asiNRL，利用Western blot、免疫荧光、全视野视网膜电图(ERG)和单细胞RNA测序(scRNA-seq)等技术评估治疗效果。主要发现cp-asiNRL能有效抑制NRL表达，上调锥状细胞标志物，改善视网膜功能。在RP模型中，虽然功能改善相对有限，但显著减少了光感受器凋亡。

【主要技术方法】
研究首先设计筛选靶向NRL的cp-asiRNA，通过体外细胞实验验证其敲除效率和安全性。随后在三种小鼠模型中实施玻璃体内注射，采用Western blot和免疫荧光检测光感受器标志物变化，通过ERG评估视网膜功能，并运用scRNA-seq分析光感受器转录组动态。激光诱导建立nAMD模型，使用Rho^P23H/+转基因小鼠作为RP模型。

【结果】

分子设计与选择
研究人员设计73种靶向NRL的asiRNA序列，最终筛选出cp-asiNRL#47-19，其IC₅₀为251.5 pM。该分子通过磷酸骨架修饰和胆固醇修饰增强细胞穿透性，MTT实验证实其在0.5-5 μM浓度范围内无细胞毒性。

WT小鼠模型中的疗效
在野生型小鼠中，cp-asiNRL处理降低了NRL表达，同时提高了锥状细胞标志物OPN1SW和OPN1MW水平。免疫荧光显示cp-asiNRL处理组中OPN1SW和OPN1MW阳性杆状细胞显著增多。ERG显示在≥1 cd·s/m²光强下视锥介导的反应增强。

CNV模型中的疗效
在激光诱导的CNV模型中，cp-asiNRL显著降低NRL和杆状细胞标志物表达，提高L/M-视蛋白水平。虽然视锥介导的功能恢复未达统计学意义，但暗适应a波和b波振幅有所恢复。

RP模型中的疗效
在Rho^P23H/+小鼠中，cp-asiNRL降低视紫红质(RHO)表达，显著提高锥状细胞标志物。TUNEL实验显示光感受器凋亡减少。虽然ERG改善未达显著水平，但免疫荧光证实S-视蛋白和L/M-视蛋白阳性细胞增加。

scRNA-seq分析
单细胞转录组分析发现，cp-asiNRL处理组中锥状光感受器标志基因显著上调，而杆状特异性标志物变化较小。拟时序分析显示存在从杆状细胞向锥状样细胞的转录组转变，证实NRL敲除促进了杆状细胞向锥状样光感受器的转化。

【结论与意义】
该研究首次证明玻璃体内注射cp-asiNRL能有效诱导成年小鼠视网膜杆状细胞向锥状样细胞转分化。与CRISPR/Cas9等基因编辑技术相比，cp-asiRNA具有递送简便、免疫原性低等优势。虽然在RP模型中功能改善有限，但分子水平的转分化证据为视网膜变性治疗提供了新思路。未来研究可优化siRNA设计以提高转分化效率，并探索与其他治疗手段的联合应用。这项由韩国建国大学团队完成的研究为无创治疗视网膜退行性疾病开辟了新途径。