Helix aspersa蜗牛卵水解物通过双重凋亡通路抑制结肠癌Caco-2细胞的机制研究

本研究针对结直肠癌治疗需求，通过体外静态消化模拟制备Helix aspersa maxima和Helix aspersa aspersa蜗牛卵水解物，系统评估其对Caco-2结肠癌细胞的毒性效应。研究发现水解物能选择性破坏癌细胞膜完整性（LDH释放增加），降低线粒体膜电位（JC-1检测），调控Bcl-W、BID、DR6等凋亡蛋白表达，通过内源性和外源性凋亡通路发挥抗癌作用，且对正常IEC-6细胞无毒性。该成果为开发新型抗结肠癌天然产物提供了实验依据。

　　

结直肠癌作为全球发病率第三、死亡率第二的恶性肿瘤，其治疗面临巨大挑战。尽管手术和放化疗是主要手段，但药物毒副作用和耐药性问题日益突出。近年来，天然产物因其多靶点作用和低毒性特点成为研究热点，其中软体动物来源的生物活性物质展现出独特优势。蜗牛组织提取物已被证实具有抗肿瘤活性，但其卵水解产物的抗癌机制尚不明确。

华沙生命科学大学生物学系纳米生物技术研究室的Magdalena Matusiewicz团队在《Scientific Reports》发表研究，通过静态体外消化模型制备两种食用蜗牛（Helix aspersa maxima和Helix aspersa aspersa）卵的水解物，系统评估其对人类结肠腺癌Caco-2细胞的毒性效应及作用机制。研究采用标准化INFOGEST消化流程，结合多组学分析技术，发现蜗牛卵水解物富含抗氧化肽（<3kDa）和糖胺聚糖（GAGs），能选择性破坏癌细胞膜完整性而不影响正常肠上皮细胞，并通过调控Bcl-2家族蛋白诱导双重凋亡通路。

关键技术方法包括：1）标准化静态体外消化模型（INFOGEST）制备水解物；2）氧化应激指标检测（FRAP、DPPH、ABTS、GSH等）；3）细胞毒性评估（LDH释放实验）；4）线粒体功能检测（JC-1染色）；5）凋亡蛋白抗体芯片分析（35种蛋白）；6）SDS-PAGE分析蛋白质/糖蛋白谱。

Redox status indicators
水解物较未消化提取物显示出更强的抗氧化能力：铁还原力（FRAP）提高2.1倍（H.a.maxima更显著），DPPH清除活性增加1.8倍，ABTS清除动力学持续180分钟。酚类物质含量最高达8.7mg GAE/g（H.a.maxima），GSH水平维持在12-15μM。值得注意的是，水解过程显著降低了蛋白质羰基（氧化损伤标志物）含量，H.a.aspersa组甚至未检出。

Content of total protein and total carbohydrates
消化使蛋白质总量降低40%（Bradford法），但SDS-PAGE显示<20kDa小分子肽增加45%（H.a.aspersa）至112%（H.a.maxima）。糖蛋白分析发现50-100kDa组分减少36-55%，而8kDa组分增加54-102%。总碳水化合物含量提升2.3倍，其中糖醛酸（GAGs组分）增加最显著。

Effect on cell membrane integrity
72小时处理后，浓缩水解物使Caco-2细胞LDH释放增加217%（H.a.maxima）和189%（H.a.aspersa），10^-3稀释组仍保持135%效应。相反，正常IEC-6细胞的膜完整性未受影响，H.a.maxima浓缩组甚至使LDH释放降低18%。

Mitochondrial membrane potential
JC-1染色显示，水解物处理72小时后Caco-2细胞橙红/绿色荧光比下降39%（H.a.maxima，p<0.05），H.a.aspersa组也呈现下降趋势（p=0.07），表明线粒体膜电位丧失，这是细胞凋亡早期关键事件。

Apoptotic proteins regulation
抗体芯片分析揭示：H.a.maxima水解物上调促凋亡蛋白BID（123%）和BIM（109%），同时增加死亡受体DR6（137%）表达；H.a.aspersa组则显著提升TRAIL-R2（119%）和TRAIL-R3（90%）水平。两组均引起抗凋亡蛋白Bcl-W过表达（111-107%），呈现复杂的凋亡调控网络。

这项研究首次阐明蜗牛卵消化产物通过多重机制发挥抗癌作用：1）抗氧化成分（酚类、GSH、小分子肽）维持氧化平衡；2）糖胺聚糖（如硫酸软骨素）选择性抑制癌细胞增殖；3）双重凋亡通路激活（线粒体途径通过BID/BIM，死亡受体途径通过DR6/TRAIL-R）。特别值得注意的是，水解物对正常细胞的无毒性特征（LDH、ROS指标阴性）为其临床应用提供了安全性依据。研究结果为开发基于软体动物来源的新型抗结肠癌制剂奠定了理论基础，也为膳食补充剂在肿瘤预防中的应用提供了新思路。未来研究可进一步解析活性肽序列，并探索与常规化疗药物的协同效应。