铜死亡诱导联合PD-L1阻断增强CAR-T细胞治疗骨肉瘤疗效的纳米药物研究

本研究针对骨肉瘤(OS)免疫抑制微环境限制CAR-T细胞疗效的难题，开发了一种基于四面体框架核酸(tFNAs)的纳米药物tFNAs@ESCu/aPD-L1，通过同步诱导铜死亡(cuproptosis)和阻断PD-1/PD-L1通路重塑肿瘤微环境。研究发现铜死亡相关基因与PD-L1表达呈正相关，该纳米药物可显著降低OS细胞PD-L1表达，促进CAR-T细胞浸润并抑制T细胞耗竭标志物LAG-3/KLRG1表达，在原位和再挑战模型中均显示出显著抑瘤效果，为实体瘤免疫代谢联合治疗提供了新策略。

　　

骨肉瘤作为最具威胁性的恶性骨肿瘤，即便经过手术和化疗联合治疗，患者5年生存率仍停滞在60%左右。近年来，靶向GD2的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法在临床试验(NCT02107963)中显示出安全性，但由于肿瘤免疫抑制微环境(TME)的物理屏障和免疫抑制特性，特别是程序性死亡配体1(PD-L1)上调导致的T细胞耗竭，使其在实体瘤中的应用效果受限。与此同时，铜代谢异常在肿瘤进展中的关键作用逐渐被揭示——肿瘤细胞对铜离子的独特敏感性使得铜死亡这一新型细胞死亡方式成为可能，但其与PD-L1表达的调控关系在骨肉瘤中尚不明确。

南方医科大学珠江医院关节与骨科的Zhenwen Huang、Nan Li等研究人员在《Cell Biomaterials》发表研究，通过生物信息学分析88例儿童骨肉瘤患者基因组数据，首次发现铜死亡相关基因(CRGs)如DLAT、FDX1等与CD274(PD-L1基因)表达呈显著正相关。为验证这一发现并开发协同治疗策略，团队构建了可同时诱导铜死亡和阻断PD-L1的纳米药物tFNAs@ESCu/aPD-L1，该药物以生物相容性四面体框架核酸(tFNAs)为载体，封装铜离子载体elesclomol-Cu(ESCu)并通过二硫键偶联PD-L1抗体(aPD-L1)，能在高谷胱甘肽(GSH)的肿瘤微环境中响应性释放。研究证实该策略可显著增强GD2特异性CAR-T细胞对骨肉瘤的治疗效果。

研究主要采用四大技术方法：(1)基于TARGET-OS数据库的生物信息学分析铜死亡相关基因与PD-L1的关联；(2)构建tFNAs纳米载体并表征其药物负载和释放特性；(3)体外3D肿瘤球体和动物模型评估纳米药物与CAR-T细胞的协同效应；(4)转录组测序和流式细胞术分析免疫微环境变化。研究样本包括临床患者数据和143B、U2OS、SJSA1三种人骨肉瘤细胞系，以及NOD-scid-IL2Rγ^null(NCG)小鼠模型。

研究结果部分：
"Cuproptosis reduces PD-L1 expression in OS"显示，生物信息学分析揭示DLAT、FDX1等CRGs与CD274显著正相关(r>0.2)。实验证实1,200 nM ESCu处理12小时可下调143B细胞中CRGs和CD274 mRNA表达，Western blot显示PD-L1和铜死亡相关蛋白(FDX1、LIAS)表达降低，而DLAT蛋白因寡聚化增加。

"Design and characterization of cuproptosis-inducing and PD-L1-blocking tFNAs@ESCu/aPD-L1 nanodrug"中，透射电镜显示tFNAs为20 nm均匀金字塔结构，原子力显微镜证实负载后厚度增加。纳米药物在pH6.5和10 mM GSH条件下分别实现ESCu(85.34%负载率)和aPD-L1(92.96%偶联率)的响应释放，满足肿瘤靶向需求。

"Nanodrug eradicates OS cells and is safe for normal cells"证实400 nM纳米药物对CAR-T细胞存活率>80%，而对骨肉瘤细胞抑制率达75%。透射电镜显示线粒体膜完整性破坏，划痕实验和Transwell显示迁移侵袭能力显著降低。

"Nanodrug induces cuproptosis and decreases PD-L1 expression in OS cells"通过Western blot和免疫荧光证实纳米药物处理后的OS细胞中PD-L1、FDX1、LIAS表达下调，流式检测PD-L1⁺细胞比例最低降至7.93%。

"Nanodrug improves the efficacy of CAR-T cells against OS"中，GD2-CAR-T细胞(转染率78.32%)与纳米药物联用使3D肿瘤球体死亡信号增强，ELISA显示IL-2、TNF-α、IFN-γ分泌增加，耗竭标志物LAG-3/KLRG1表达显著降低。

动物实验显示，tFNAs@ESCu/aPD-L1+CAR-T组在原位模型21天后肿瘤荧光信号降低90%，CD8⁺T细胞浸润率达43.70%，肺转移显著减少。再挑战实验中该组记忆T细胞(CD44⁺)比例达24.15%，显著高于单药组。

研究结论指出，该工作首次阐明骨肉瘤中铜死亡与PD-L1的正向调控关系，开发的纳米药物通过三重机制发挥作用：(1)ESCu诱导铜死亡破坏肿瘤代谢；(2)aPD-L1阻断免疫检查点；(3)重塑TME增强CAR-T细胞浸润。转录组分析显示该策略抑制TCA循环和FGFR1通路，同时激活STING和IL-12通路促进免疫应答。相较于临床使用的Atezolizumab单抗，纳米药物组合使抑瘤效果提升3倍，且具有器官特异性蓄积优势。该研究为克服实体瘤CAR-T治疗障碍提供了可推广的免疫代谢重编程策略，具有显著的转化潜力。