Erabutoxin突变体在人胎儿与成人型肌肉烟碱乙酰胆碱受体界面选择性的功能研究

本研究针对α-神经毒素(α-neurotoxins)对nAChRs亚型选择性机制不清的问题，通过构建Erabutoxin A(Ea)的6个单点突变体，系统研究其对人类胎儿(α1β1γδ)和成人(α1β1γε)肌肉型烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs)的抑制作用。采用非洲爪蟾卵母细胞双电极电压钳技术，首次揭示S8T和K47E突变体优先靶向α1-δ界面，K27E和D31H偏好α1-ε界面，为设计靶向nAChRs的功能选择性探针奠定基础。

　　

在蛇毒研究的瑰宝中，三指毒素(three-finger toxins, 3FTxs)因其独特的结构和精准的靶向性，成为神经科学研究的"分子手术刀"。其中α-神经毒素(α-neurotoxins)能特异性阻断烟碱乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs)，这种受体在神经肌肉信号传递中扮演关键角色。然而长久以来，科学家们面临一个核心难题：这些毒素如何区分人类肌肉nAChRs不同亚型界面？特别是胎儿(α1₂β1δγ)和成人(α1₂β1δε)亚型间的细微差异，直接影响着神经毒素的治疗应用潜力。

新加坡国立大学的研究团队选择海蛇毒素Erabutoxin A(Ea)作为研究对象，通过精巧的蛋白质工程和电生理技术，揭示了毒素-受体相互作用的精确识别密码。这项发表在《Biochemical Pharmacology》的研究，不仅破解了毒素亚型选择性的结构基础，更为设计精准靶向nAChRs的分子探针提供了全新思路。

研究采用三大关键技术：1) 定点突变构建Ea的6个关键位点突变体(S8T、Q10A、K27E、D31H、R33E、K47E)；2) 非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞异源表达人类胎儿/成人型nAChRs；3) 双电极电压钳(two-electrode voltage clamp)记录乙酰胆碱诱发电流的抑制效应。

【蛋白表达与折叠】
CD光谱证实所有突变体均保持典型3FTx的β-折叠结构，212nm处特征性最小吸收峰验证了蛋白正确折叠，为后续功能研究奠定基础。

【活性分析】
野生型Ea对两种亚型nAChRs的半数抑制浓度(IC₅₀)分别为7nM(胎儿型)和10nM(成人型)，而R33E突变体几乎完全丧失抑制活性，提示Arg33是维持毒性的关键残基。

【界面选择性机制】
通过Hill方程分析发现：S8T和K47E突变体展现出α1-δ>α1-γ>α1-ε的层级选择性；相反，K27E和D31H则偏好α1-ε界面。尤其值得注意的是，K47E突变体对α1-δ的亲和力比α1-ε高两个数量级，这种"分子尺规"般的精确区分，为理解毒素-受体互作提供了结构模板。

这项研究首次系统绘制了Ea突变体在人源nAChRs上的"识别图谱"，揭示Loop I的Ser8和Loop III的Lys47构成α1-δ界面的"分子锁钥"，而Loop II的Lys27和Asp31则是识别α1-ε的"密码子"。这些发现不仅深化了对神经毒素作用机制的理解，更为开发靶向特定nAChR亚型的治疗药物提供了设计蓝图——比如针对重症肌无力中异常表达的ε亚基，或疼痛治疗中特定的受体组合。正如研究者指出，这种"界面选择性"策略可拓展至其他Cys-loop受体家族，为精准神经药理学研究开辟新途径。